Информации

3.2: Природни и неприродни групи - Биологија

3.2: Природни и неприродни групи - Биологија



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Вреди да се повтори дека иако еден вид може да се гледа како природна група, повисоките нивоа на класификација може или не одразуваат биолошки значајни информации. Можеме да бидеме сигурни дека ја читаме истата книга и го проучуваме истиот организам!

Родовите и другите класификации на повисоко ниво генерално се засноваат на одлука да се смета една или повеќе особини како поважни од другите. Доделувањето одредена вредност на особина може да изгледа произволно. Да го разгледаме, на пример, родот Canis, кој вклучува волци и којоти и родот Vulpes, кој вклучува лисици. Разликата помеѓу овие две групи се заснова на помали димензии и порамни черепи во Vulpes во споредба со Canis. Сега да го испитаме родот Felis, обичната домашна мачка и родот Panthera, кој вклучува тигри, лавови, јагуари и леопарди. Овие два рода се разликуваат по кранијалните карактеристики и дали (Патера) или не (Феликс) имаат способност да рикаат. Значи, што правиме ние од овие разлики, дали тие навистина се доволни за да се оправдаат различни групи или треба да се спојат Канис и Вуплс (и Феликс и Пантера) заедно? Дали разликите меѓу овие групи се биолошки значајни? Одговорот е дека честопати основата за класификации од повисок ред не се биолошки значајни. Овој заеднички недостаток на биолошко значење е подвлечен со фактот дека класификацијата на организам од повисок ред може да се промени: родот може да стане семејство (и обратно) или видот може да се премести од еден род во друг. Размислете за видовите на организми попознати како мечки. Постојат голем број на различни видови на организми слични на мечка, факт што шемата за класификација на Линеус го признава. Гледајќи ги сите организми слични на мечка, препознаваме осум видови.59 Во моментов сметаме дека четири од нив, кафеавата мечка (Ursus arctos), азиската црна мечка (Ursus thibetanus), американската мечка (Ursus americanus) и поларната мечка (Ursus maritimus) се значително послични една на друга, врз основа на за присуството на различни особини, отколку што се кај другите видови мечки. Затоа ги сместивме во нивниот сопствен род, Урсус. Го сместивме секој од другите видови на организми слични на мечка, мечка со очила (Tremarctos ornatus), мрзлива мечка (Melurus ursinus), сончева мечка (Helarctos mayalanus) и џиновска панда (Ailuropoda melanoleuca) во свои посебни родот, бидејќи научниците сметаат дека овие видови се поразлични еден од друг отколку членовите на родот Ursus. Проблемот овде е колку големи треба да бидат овие разлики за да се гарантира нов род?

Па каде не остава тоа? Овде се спојуваат теоријата на еволуцијата заедно со теоријата за клетката (континуитет на животот). Работиме на претпоставката дека колку повеќе се поврзани (еволутивно) два вида, толку повеќе особини ќе споделуваат и дека развојот на нова, биолошки значајна карактеристика е она што ја разликува групата од друга. Карактеристиките кои се во основата на шемата за рационална класификација се познати како синапоморфии (технички термин); во основа, ова се особини што се појавуваат во едната или другата гранка на семејното стебло и служат за дефинирање на таа гранка, така што организмот на едната гранка е дел од „природна“ група, различна од оние на другата гранка (лоза). . На ист начин како што изобличувањето на простор-времето даде причина зошто постои закон за гравитација, така и односите на предците меѓу организмите даваат причина зошто организмите можат да се подредат во линеска хиерархија.

Значи, преостанатото прашање е, како да го одредиме потеклото кога живееле предците, илјадници, милиони или милијарди години во минатото. Бидејќи не можеме да патуваме назад во времето, мораме да ги заклучиме односите од компаративните студии на живите и фосилизираните организми. Тука биологот Вили Хениг одигра клучна улога.60 Тој воспоставил правила за користење на споделени, емпириски мерливи особини за реконструкција на односите на предците, така што секоја група треба да има единствен заеднички предок. Како што ќе откриеме подоцна, една од карактеристиките што сега најчесто се користи во современите студии е секвенцата на гените (ДНК) и податоците за геномската организација, иако дури и овде има многу ситуации каде што остануваат нејаснотии, поради многу долгите времиња што ги раздвојуваат предците и денешните организми.


Систем за прикажување на фаги со неприродни амино киселини

Прегледите на написите се збир од преземања на целосни текстуални написи од ноември 2008 година (и во PDF и во HTML) во КОЛУРА во согласност со сите институции и поединци. Овие метрики редовно се ажурираат за да го одразуваат користењето што води до последните неколку дена.

Цитатите се бројот на други статии што го цитираат овој напис, пресметан од Crossref и ажуриран секојдневно. Најдете повеќе информации за броењето на цитати Crossref.

Altmetric Attention Score е квантитативна мерка за вниманието што го добива на интернет на една истражувачка статија. Со кликнување на иконата за крофна ќе се вчита страница на altmetric.com со дополнителни детали за резултатот и присуството на социјалните мрежи за дадената статија. Најдете повеќе информации за Altmetric Attention Score и како се пресметува резултатот.


1. Вовед

Протеините се суштински компоненти на синтетичките клеточни мрежи. Синтезата на клеточните патишта со крајна цел да се создадат функционални вештачки клетки може да има голема корист од генерирањето на протеини со посакувани својства кои можат ефикасно да се регулираат. Протеините способни да функционираат независно од ендогеното коло на организмот-домаќин бараат дополнителен развој во дизајнот на „делови“.

Неодамнешните достигнувања во преназначувањето на генетскиот код на неприродни амино киселини (UAA) 12,14-16 ја прошируваат молекуларната кутија со алатки на протеинските „делови“. Всушност, воведувањето на UAA може да даде нови функции кои е тешко или невозможно да се создадат со протеини составени од природни 20 аминокиселински градбени блокови, како што се фото-индуцирано префрлување, 17 IR сонда активни 18 и редокс чувствителни 19 протеини. Покрај тоа, протеините кои содржат UAA може да резултираат со подобрени својства како што се хиперстабилност 20,21 и отпорност на протеаза. 22 Таквите карактеристики може да бидат корисни за приспособување на ортогонални протеини во контекст на синтетички биолошки мрежи. Овде разговараме за пристапите кои се фокусираат на инженерството на протеини и кои потенцијално можат да ги прошират методите на синтетичката биологија со инкорпорирање на UAA за создавање на вештачки протеини.


Биолошки вештини што ќе ги научите

  • Истражете многу од широките концепти кои го поткрепуваат нашето разбирање за природниот свет.
  • Стекнат искуство со спроведување на научниот метод, вклучувајќи тестирање на хипотези, експериментален дизајн, пристап и разбирање на научната литература и анализа на податоци.
  • Стекнете ги знаењата и практичните вештини потребни за да бидете високо конкурентни за исклучителни можности за кариера по дипломирањето или да продолжите со диплома за постдипломски студии.

Шаблонска синтеза на неприродни нуклеински киселини

Пристапот на фосфорамидит кон синтезата на ДНК во цврста фаза [38, 39] развиен во раните 1980-ти доведе до мејнстрим употреба на синтетичка ДНК во огромен број апликации. Слично на тоа, може да се очекува дека подобрувањата во синтезата на XNA ќе ја зголемат нивната употреба и ќе отклучат нови апликации во наредните децении. Синтезата на XNA може широко да се подели на ензимски и неензимски пристапи. Некои широко користени XNA (на пример, 2'OMe, LNA, PS, 2'MOE) можат хемиски да се синтетизираат, иако приносите дури и на синтетички најпристапните XNA се ограничени на околу 150 bp [40]. За другите хемикалии на XNA, не е познат сигурен цврстофазен синтетички пат [41]. Понатаму, синтезата во цврста фаза зависи од експлицитното познавање на низата што се синтетизира. Спротивно на тоа, шаблонската синтеза овозможува општ пренос на информации и е од суштинско значење за еволуцијата на функционалните олигонуклеотиди.

Неензимска шаблонска синтеза

Синтезата со неензимски шаблони традиционално користи активирани нуклеотиди или кратки олигонуклеотидни градежни блокови кои се самоорганизираат на шаблон преку интеракции со разделување на базите и реагираат на полимеризација. Таквото копирање на шаблоните, пионерско во 1970-тите [42,43,44], е проширено на неколку XNA хемии [45,46,47,48,49,50,51,52,53], често во контекст на пребиотични нуклеински репликација на киселина. На пример, системите за шаблонска репликација на PNA пентамери [54, 55] со помош на редуктивна аминација се доволно ефикасни за да дозволат експерименти за избор на модел [56]. Слични стратегии, исто така, беа искористени за да се соберат нуклеински киселини преку бакар-катализирана кликна лигатура на олигонуклеотиди [57, 58] и со фосфорамидатска лигатура [59], а добиените 'рбети покажаа одредена биокомпатибилност [60]. Во интересна екстензија на оваа работа, шаблони на нуклеинска киселина исто така се користени за организирање на хемиски ентитети по близина за програмирани реакции [61,62,63]. Конкретно, групата Лиу ги прошири таквите шаблонски пристапи за синтеза за хемиски да ги врзува различните ентитети од ненуклеинска киселина во прецизни секвенци дефинирани со шаблон на ДНК [64]. Ваквите шаблонски хемиски синтези овозможуваат се повеќе дивергентни хемии да се синтетизираат и реплицираат без ограничување на разновидноста на полимерите со способноста на неговите составни мономери да служат како супстрати за полимеразите или другите ензими кои менуваат нуклеинска киселина.

Ензимска лигатура и модификација на XNA

Се покажа дека неколку ДНК лигази прифаќаат неприродни супстрати и се користат сами или заедно со XNA полимеразите за синтеза на XNA олигонуклеотиди. Слично како гореспоменатите стратегии за хемиска лигатура, ензимското поврзување на претходно организирани олигомери на шаблон овозможува позиционирање на модифицирани нуклеотиди, вклучувајќи повеќе различни модификации, на дефинирани локуси. Неодамна се покажа дека неколку комерцијално достапни лигази можат да ја катализираат лигатурата на XNA супстрати вклучувајќи 2'OMe, HNA, LNA, TNA и FANA [41, 65]. Згора на тоа, пристапите на рационален дизајн и молекуларно моделирање сега резултираа со првата XNA-шаблони XNA лигаза [66]. Групите Лиу и Хили, исто така, работеа интензивно со лигаза-посредувана синтеза на модифицирана ДНК од различно функционализирана ДНК 3- или 5-мери [67, 68], овозможувајќи голем избор на модификации, вклучувајќи хидрофобни, алифатични, ароматични, киселински и основни делови, кои треба да се вградат со користење на овие кратки „квазикодони“. Во согласност со резултатите добиени со SOMAmer (Slow Off-rate Modified Aptamer) селекции [22], тие откриваат дека функционализацијата со неполарни делови се чини дека промовира побрза конвергенција на селекцијата и посилно врзување на аптамер [21]. Вклучувајќи хемиска разновидност надвор од онаа што се наоѓа во протеините (на пример, халогенирани остатоци), групата изолираше аптамери со висок афинитет против PCSK9 и интерлеукин-6 [69]. Горенаведените стратегии ја инкапсулираат парадигмата на искористување на уникатните својства на нуклеинските киселини (т.е., кодирана синтеза, еволутивност) заедно со проширен сет на хемиски супституенти за да се создадат функционални молекули со терапевтски потенцијал.

Синтеза на полимераза на XNA

Ензимската полимеризација на нуклеинските киселини е побрза и попрецизна од редот на големината од хемиското копирање или синтеза и сега се спроведува за синтеза на олигонуклеотиди на следната генерација на ДНК [70, 71], со цел да се замени технологијата на фосфорамидит. Слично на тоа, ензимската XNA синтеза може да го олесни производството на XNA олигонуклеотиди. XNA со хемиски конзервативни модификации се прифатени како супстрати од природни полимерази, додека инженерството на полимеразите за прифаќање на поширок опсег на XNA супстрати, исто така, наиде на успех [72, 73]. Навистина, некои полимерази се покажаа како високо приспособливи на нови супстрати. Термофилни полимерази од Б-фамилијата, особено оние од Пирокок и Термокок родовите, се покажаа особено подложни на инженерството за XNA подлоги [33, 74,75,76,77,78,79,80,81]. Оваа функционална пластичност може да биде потпомогната од високата термостабилност, која промовира поголема толеранција за мутации кои инаку би биле претерано дестабилизирачки. Сепак, А-фамилија [82,83,84,85,86,87,88,89,90] и мезофилни полимерази како што се Phi29 [91, 92] како и РНК полимерази [93,94,95,96,97 ] се исто така дизајнирани да прифаќаат XNA подлоги со успех (Табела 1). Сепак, ефикасноста, верноста и кинетиката на инженерските полимерази на XNA супстратите обично се компромитирани во однос на природните ензими и природните супстрати. Честопати, потребни се „присилни“ услови (на пр., концентрации на суперстоихиометриска полимераза или присуство на Mn 2+, што пак ја намалува верноста) за да се зголемат синтетичките приноси [106].

Капитализирање на промискуитетот на природните полимерази

Можеби е извонредно што природните полимерази можат воопшто да инкорпорираат модифицирани нуклеотиди, со оглед на нивната потреба за строга специфичност и точност на супстратот. Сепак, на некои позиции во нуклеотидот, модификациите лесно се толерираат. На пример, модификациите на C5 позицијата на пиримидините и C7 позицијата на N7-деаза-пурините се проектираат во главниот жлеб на дуплексот и не се мешаат во спарувањето на базите Watson-Crick. Затоа, дури и гломазните адукти на овие позиции генерално добро се поднесуваат од полимеразите [22, 107,108,109,110,111,112]. Ензимската синтеза на нуклеотиди со реактивни групи (на пример, за бакар-катализирана хемија на кликање) на овие позиции може да дозволи елаборирани пост-синтетички модификации [113,114,115,116,117].

Пластичноста на полимеразите, исто така, им овозможи на истражувачите да вршат големо замена на природните бази со блиски хемиски аналози [118, 119]. Во некои случаи, синтезата е доволно ефикасна за да произведе модифицирани PCR производи до 1,5 kb [119]. Покрај тоа, развиени се целосно нови неприродни базни парови (UBP) врз основа на нови обрасци на водородни врски [105, 120], хидрофобност [121, 122] и комплементарност на обликот [123,124,125]. Овие UBP може да се реплицираат со инженерски и природни полимерази, демонстрирајќи успешно проширување на генетскиот код и неодамна постигнувајќи информации што се кодираат во невидена генетска азбука со осум букви [120].

Синтеза на XNA ин виво

Синтезата и репликацијата на XNA in vivo претставува важна граница во истражувањето на XNA кон цели како што се стабилно кодирање на неприродни амино киселини и генетска ортогоналност за „заштитување“ на синтетичката биологија. За таа цел, целосна замена на цитидин и/или тимидин со 5-супституирани аналози на пиримидин во бактериските геноми сега е постигната со внимателен метаболички инженеринг и еволуција [126,127,128,129].

Неверојатно, Ромесберг и неговите колеги беа во можност да инженерираат Ешерихија коли соеви со капацитет да се реплицираат и одржуваат нивниот неприроден базен пар NaM-TPT3 и во плазмиден [130] и во геномски [131] контекст. За да го постигнат ова, тие конструираа транспортер на нуклеозид трифосфат [132], го повикаа Cas9 за да ги деградира секвенците што ја изгубија UBP и направија неколку измени на Ешерихија коли Машини за синтеза и поправка на ДНК. Тие дополнително ја демонстрираа компатибилноста на UBP со преведувачката машинерија за специфично шифрирање на неприродни амино киселини [133, 134]. Понатамошни полусинтетички организми со супституирани геноми или способност да се размножуваат UBP најверојатно ќе ги следат овие рани успеси [135, 136].

Насочена еволуција за инженерството на XNA полимераза

Додека модификациите на базите, па дури и целосно новите базни парови се толерирани од природните полимерази во различен степен, модификациите на шеќерот и ’рбетот генерално се покажуваат попредизвикувачки, особено при целосна замена. За да се подобри активноста со такви неприродни супстрати, често се користат полимеразни инженерски пристапи, кои се движат од рационално инженерство поттикнато од структурни увиди или пресметковна анализа до скрининг и насочена еволуција. Меѓу нив, методите базирани на емулзија и прикажувањето на фагот се особено корисни [137, 138].

На терен се користени низа стратегии за насочена еволуција. Компартментализирана саморепликација (CSR) [139,140,141] ги предизвикува полимеразите да PCR го засилуваат сопствениот ген во одделот за емулзија. Експоненцијалното збогатување на високо активните клонови, наспроти едноставното партиционирање на активните варијанти, го прави ООП моќен метод. Сепак, тој поставува строги барања за перформансите на полимеразата, кои донекаде се олеснуваат при CSR со краток лепенка (spCSR) [85] каде што засилувањето е ограничено само на краток дел од генот на полимеразата. Вгнездениот CSR овозможува избор на секвенци или карактеристики кои не се присутни во самиот ген на полимераза (на пр., нови базни парови, обратна транскрипција на шаблони на XNA) со користење на вгнездени прајмери ​​со овие карактеристики за време на чекорот за засилување на CSR [79, 86]. Понатамошното проширување наречено компартментализирана партнерска репликација (CPR) може да се користи за избор на ензимски активности различни од полимеризацијата на нуклеинската киселина со ограничување на PCR реакцијата што може да се избере со соодветноста на партнерскиот ген [86, 142]. Неодамна, CSR беше прилагоден и за изотермални реакции на засилување (iCSR), и на високи температури [143] и на пониски температури за еволуција на нетермостабилни ензими [91]. Преграденото самообележување (CST) [144] овозможува селекција за многу потешки супстрати или услови изборот се заснова на продолжеток на прајмер образложен од плазмидот за кодирање. Биотинилираниот прајмер заедно со сите плазмиди кои биле „заробени“ со доволно продолжување на прајмерот се поделени на стрептавидински зрна. CST дава полимерази за опсег на XNA [78], неодамна за dxNA [145]. За разлика од методите на масовна емулзификација, микрофлуидните уреди се користени за генерирање на високо хомогени капки на емулзија, што ја подобрува способноста за прецизно разликување на малите инкрементални подобрувања важни во чекори селекции [146, 147]. Друга насочена стратегија за еволуција е прикажувањето на фагот, при што полимеразите прикажани на честичките на фагот се предизвикуваат да го прошират прајмерот со раздвојливи (на пр., биотинилирани) нуклеотиди [80, 89, 148]. Во една забележителна неодамнешна употреба на приказ на фаг за еволуција на полимераза, Чен и сор. идентификувани неколку Taq варијанти способни за синтетизирање и обратна транскрипција на 2'OMe РНК [88], XNA од особен интерес за терапевтиката поради неговата висока биостабилност и отпорност на нуклеаза.

Рационално инженерство на XNA полимеразите: структурни согледувања

Полимеразите остваруваат многу клучни контакти со влезниот нуклеотид трифосфат и прајмерната нишка за време на каталитичкиот циклус [149]. Структурите на полимеразите во комплекс со модифицирани супстрати затоа може да помогнат и во рационалното инженерство и во ретроспективното разбирање на XNA полимеразите. Неодамна, Кроп и сор. решени тројни структури на KlenTaq полимеразата со C5-модифициран цитидин на секоја од шесте последователни позиции [150] во циклусот на катализа, рекапитулирајќи го движењето на модифицираниот супстрат низ активното место на полимеразата и откривајќи изненадувачко ниво на флексибилност и во модифицираниот нуклеотид и интерактивните полимеразни остатоци за да се приспособат на модификацијата.

Синг и сор. [151] со структури на инженерски KlenTaq во бинарна пред-инкорпорација и троен пост-инкорпорациски комплекс со неприродниот базен пар dZ:dP. Иако ниту една од мутираните аминокиселини не е во директен контакт со прајмерот, шаблонот или дојдовниот dZTP, структурата сугерира дека зголемената флексибилност, особено во поддоменот на палецот, и зголемениот агол на затворање во поддоменот на прстот го олеснува издолжувањето на прајмерот со неприродната основа пар.

Чим и сор. неодамна пријавени тројни структури на хипертермофилна полимераза од Б-фамилија, инженерски KOD мутант, полимеризирачка ТНА [152]. Со оглед на распространетата употреба на хипертермофили од Б-фамилијата во инженерството на полимераза, структурите на апо, бинарните и тринарните полимеразни комплекси ќе се покажат корисни во развојот на хипотези за понатамошна работа на терен. Последователно објавените тројни структури на KOD и 9°N со ДНК прајмер и шаблон и дојдовен dNTP [149, 153] сугерираат можни објаснувања за предиспозицијата на хипертермофилните археални Б-фамилијарни полимерази за инженерство: невообичаено широк и позитивно наелектризиран канал помеѓу прстот и поддомените на палецот може да овозможат простор за модификации на подлогата додека одржуваат силно врзување за шаблонот и висока процесност. Дополнително, додека дуплексот на шаблонот за прајмер усвојува А-форма во активното место на полимеразите од А-фамилија, тој усвојува Б-форма во KOD, што веројатно придонесува за сместување на нуклеотидните модификации во поширокиот главен жлеб на дуплексот Б-форма.

Рационално инженерство на XNA полимеразите: превод на мутации низ супстрати и полимерази

Постојат бројни примери на преносливи мутации низ XNA супстрати и полимерази. Неодамнешниот извештај [154] го детализира инженерството на претходно опишаниот Taq мутант за подобро инкорпорирање на 2' модифицирани XNA. Од кинетичките податоци за инкорпорирање на различни 2' модифицирани нуклеотиди, релевантни мутации од литературата беа избрани врз основа на хипотезата дека чекорот за ограничување на брзината може да биде препознавање на модифицираната прајмерна нишка. Неколку мутанти покажаа засилена синтеза на 2'F и 2'OMe и/или обратна транскрипција на 2'OMe РНК. Во друг пример, диверзификацијата на осум „остатоци што ја одредуваат специфичноста“ избрани со пресметковна анализа, еволутивна конзервација и литературен преседан дадоа подобрени полимерази за РНК и ТНА [75]. Понатаму, тестирањето на врвните множества на мутации во контекст на различни хомологни полимерази од Б-фамилијата ја докажа нивната општа корист, како и откривање на структурниот контекст во кој тие најдобро функционираат. Слично на тоа, синтезата на полимераза на повеќе различни XNA беше постигната со TNA полимераза со комбинирање на TNA шеќер со базни модификации за кои се знае дека се компатибилни со полимераза [31, 32]. Иако општо се веруваше дека мутацијата на зачуваните остатоци е многу штетна, станува сè поочигледно преку оваа и друга работа дека таквите мутации можат да бидат клучни за дозволување активност со неприродни супстрати [75, 155].

Лиу и сор. неодамна објави инженерство на полимераза за синтеза на ново опишаната XNA, tPhoNA, со модификации и на шеќер и на 'рбетот [33]. Импресивно, стратегијата за инженерство на полимераза се состоеше само од последователно воведување и евалуација на мутации на позиции за кои е познато дека влијаат на синтезата за други XNA супстрати. Нивниот успех е доказ за акумулираната база на знаење во областа на полимеразното инженерство и извонредната способност на мал број специфични клучни мутации да доделат проширен спектар на супстрат.

РНК полимеразите исто така се конструирани да синтетизираат XNA. Се покажа дека T7 RNAP може да транскрибира РНК со проширена содржина од ДНК што содржи Ds-Pa UPB, како и дополнително модифицирани Pa бази [103]. Преку мал екран на претходно идентификувани мутации, Кимото и сор. идентификуван T7 RNAP мутант кој инкорпорира 2'-F урацил и цитидин трифосфати и покажува подобрена инкорпорација на нуклеотидите на Pa и нивните аналози во контексти со тешка секвенца [93]. Изненадувачки, неколку гломазни модификации на нуклеотидот Pa дизајнирани да ја прошират хемиската разновидност за селекции на аптамери и рибозим се чини дека се уште подобри супстрати од оригиналните трифосфати на Pa. Слично на тоа, мутант на Tgo полимераза, кој претходно еволуирал за да синтетизира ХНА, неодамна се покажа дека инкорпорира ХНА нуклеотиди со различни ароматични модификации на уридинската база [35]. И овде, некои од поголемите модификации на основата покажаа супериорна инкорпорација.

Обратна транскрипција на XNA

Идентификацијата на ензими способни за обратна транскрипција на XNA го демонстрира потенцијалот на овие дивергентни хемии како генетски материјали и е од клучно значење за ин витро селекции [156]. Некои XNA може да бидат обратно транскрибирани со природни полимерази (на пр., TNA и FANA со Bst полимераза [157,158,159]). Наизменично, мора да се преземат инженерски пристапи [79, 88]. Мал број на мутации кај Тго полимеразата дала реверзна транскриптаза со генерално проширен спектар на супстрат што може да реверзибира неколку XNA во ДНК [29, 78].

Анализа на XNA и XNA полимерази

Една од тешкотиите во работата со XNA е тоа што тие често се некомпатибилни со традиционалните методи на манипулација или анализа на нуклеинската киселина, како што се рестриктивните ензими и технологиите за секвенционирање. Така, важен паралелен напор за развој на XNA и XNA полимерази е развојот на алатки за нивна анализа. На пример, верноста не е детално проценета за многу од опишаните XNA полимерази. Неодамнешниот метод за проверка на верноста објави дека дури и релативно малите и природни модификации на РНК можат значително да ги зголемат стапките на грешка на полимеразата [160]. Длабокото секвенционирање исто така е искористено за да се истражат профилите на грешки и читањето на полимеразата на шаблоните со модификации на 'рбетот [161] и откриле дека некои вообичаено користени изостерични модификации, како што се фосфоротиоатите, предизвикале значителни грешки при копирање. Овој податок за верност навестува важно ограничување во ензимската синтеза на XNA што најверојатно ќе треба да се реши додека полето се движи напред. Од друга страна, промискуитетното однесување на полимеразите е искористено за читање и снимање на присуството на епигенетски модификации на ДНК и РНК преку погрешни „потписи“ на модификациите [162,163,164,165,166,167,168,169,170]. Дополнително, неодамна беше пријавено дека првиот случај на директно секвенционирање на XNA FANA е секвенционирана со помош на технологија на нанопори, иако со релативно кратки должини за читање [171].

XNA особено ограничена поради недостаток на алатки е L-DNA. Таквата ДНК „огледална слика“ обезбедува и целосна ортогоналност во карактеристиките и интеракциите на макромолекулата, додека одржува идентични својства на ДНК на хемиско ниво. Така, ензимската синтеза на L-DNA бара полимерази од огледална слика направени од D-амино киселини. Жу и неговите колеги први направија Д-форма на најмалата позната полимераза, полимеразата Х од вирусот на африканска свинска чума, и ја искористија за синтетизирање на Л-ДНК, покажувајќи дека полимеразата е строго специфична за енантио без вкрстена инхибиција од Д-нуклеотидните трифосфати. 102]. Групата последователно пријави синтеза на мутант на поголемата термостабилна Dpo4 полимераза со D-амино киселини, што овозможи PCR засилување на L-DNA производ [99, 100]. Клусман и неговите колеги, исто така, пријавиле синтеза на мутант D-Dpo4 [101], кој се користел за составување на секвенци на L-DNA со должина на ген. Пријавена е и лигаза од огледална слика [172]. Нуклеинските киселини со огледална слика се од огромен интерес за терапевтски средства и активно се спроведуваат во истражувањето и клиничкиот развој [173]. Сепак, нивната употреба останува ограничена поради напорниот процес на синтетизирање на Д-полимеразите и некомпатибилноста на L-ДНК со традиционалните алатки за манипулација со нуклеинска киселина.


Хемија во живите системи

Дисекцијата на сложените клеточни процеси бара способност да се следат биомолекулите додека функционираат во нивното родно живеалиште. Иако генетски кодираните ознаки како што е GFP се широко користени за следење на дискретни протеини, тие можат да предизвикаат значителни нарушувања на структурата на протеинот и немаат директно проширување на другите класи на биомолекули како што се гликаните, липидите, нуклеинските киселини и секундарните метаболити. Во последниве години, алтернативна алатка за означување на биомолекули се појави од заедницата на хемиската биологија - биоортогоналниот хемиски известувач. Во прототипски експеримент, уникатен хемиски мотив, честопати мал како една функционална група, се вградува во целната биомолекула користејќи ја сопствената биосинтетичка машинерија на клетката. Хемискиот известувач потоа е ковалентно модифициран на високо селективен начин со егзогено испорачана сонда. Овој преглед го нагласува развојот на биоортогонални хемиски известувачи и реакции и нивната примена во живите системи.


3.2: Природни и неприродни групи - Биологија

Антропологија

Луѓе и култури во минатото и денес

Археологија

Луѓе и артефакти од античко време

Астрономија

Универзумот и се што е во него

Биодиверзитет

Богата разновидност на живот на Земјата

Мозок

Органот во нашите черепи

Климатска промена

Долгорочни промени во глобалната температура

Земјата

Динамична планета која ја нарекуваме дом

Генетика

Како гените се пренесуваат генерации

Морска биологија

Микробиологија

Бактерии, вируси и други микроорганизми

Палеонтологија

Диносауруси и други работи што живееле многу одамна

Физика

Материјата и нејзиното движење низ просторот и времето

Вода

Течноста што го овозможува животот на Земјата

Зоологија

Сите животни од инсекти до цицачи

Ологиска картичка на денот: Дали знаеше?

Коалите не се мечки. Тие се торбари и се потесно поврзани со кенгурите.

Некои метеорити се мали парчиња на Месечината.

Ако се стопат, ледените плочи што го покриваат Антарктикот ќе го подигнат глобалното ниво на морето за речиси 70 метри (230 стапки).

Лилјаците се единствените цицачи кои навистина можат да летаат.

Светулките воопшто не се муви. Тие се бубачки!

Антарктикот е континент опкружен со океан. Арктикот е спротивен, океански пространство опкружено со континенти.

"Ѕвездите кои пукаат" се всушност метеори.

На многу сауроподи им растеле нови заби еднаш месечно, додека старите се истрошеле.

Некои метеорити се стари колку и Сончевиот систем.

Половина милион неврони се формираат секоја минута во првите пет месеци од утробата.

Идентичните близнаци имаат потполно исти гени, но нивните отпечатоци од прсти се единствени.


Што е вештачка селекција

Вештачката селекција е селективно одгледување на животни и растенија за да се добие потомство со посакувани и наследни карактери. Вештачката селекција е вештачки процес на селекција на посакуваните ликови и главно се користи во сточарството и подобрените култури. Фармерите користеле вештачко размножување дури и пред генетиката за откривање на Дарвин за да ги задржат наследните карактери што ги посакувале и кај животните и кај растенијата. Корисните карактери како што се способноста за производство на повеќе млеко кај говедата, забрзаниот раст на слаб мускул, егзотичните миленичиња како мачката Савана и малите кучиња како Чивава се произведуваат со вештачко размножување. Белгиската крава се одржува со селективно одгледување поради нејзиниот забрзан раст на чистата мускулатура.

Слика 3: Белгиска крава

Понатаму, вештачката селекција се користи во производството на нераскажана разновидност во растенијата. Видовите на пченка, пченица и соја се развиваат со вештачка селекција на корисни својства во земјоделството. Broccoli, Brussels sprouts, cabbage, cauliflower, collards, and kale are produced by the careful selective breeding of wild mustard. Roses and orchids are also cultivated by selective breeding. Artificial selection can also produce various colors in carrot roots.

Figure 4: Carrots with multiple colored roots


2. Kin Selection and Inclusive Fitness

The basic idea of kin selection is simple. Imagine a gene which causes its bearer to behave altruistically towards other organisms, e.g. by sharing food with them. Organisms without the gene are selfish&mdashthey keep all their food for themselves, and sometimes get handouts from the altruists. Clearly the altruists will be at a fitness disadvantage, so we should expect the altruistic gene to be eliminated from the population. However, suppose that altruists are discriminating in who they share food with. They do not share with just anybody, but only with their relatives. This immediately changes things. For relatives are genetically similar&mdashthey share genes with one another. So when an organism carrying the altruistic gene shares his food, there is a certain probability that the recipients of the food will also carry copies of that gene. (How probable depends on how closely related they are.) This means that the altruistic gene can in principle spread by natural selection. The gene causes an organism to behave in a way which reduces its own fitness but boosts the fitness of its relatives&mdashwho have a greater than average chance of carrying the gene themselves. So the overall effect of the behaviour may be to increase the number of copies of the altruistic gene found in the next generation, and thus the incidence of the altruistic behaviour itself.

Though this argument was hinted at by Haldane in the 1930s, and to a lesser extent by Darwin in his discussion of sterile insect castes in Потеклото на видовите, it was first made explicit by William Hamilton (1964) in a pair of seminal papers. Hamilton demonstrated rigorously that an altruistic gene will be favoured by natural selection when a certain condition, known as Hamilton's rule, is satisfied. In its simplest version, the rule states that б > в/р, каде в is the cost incurred by the altruist (the donor), b is the benefit received by the recipients of the altruism, and r is the co-efficient of relationship between donor and recipient. The costs and benefits are measured in terms of reproductive fitness. The co-efficient of relationship depends on the genealogical relation between donor and recipient&mdashit is defined as the probability that donor and recipient share genes at a given locus that are &lsquoidentical by descent&rsquo. (Two genes are identical by descent if they are copies of a single gene in a shared ancestor.) In a sexually reproducing diploid species, the value of r for full siblings is ½, for parents and offspring ½, for grandparents and grandoffspring ¼, for full cousins 1/8, and so-on. The higher the value of r, the greater the probability that the recipient of the altruistic behaviour will also possess the gene for altruism. So what Hamilton's rule tells us is that a gene for altruism can spread by natural selection, so long as the cost incurred by the altruist is offset by a sufficient amount of benefit to sufficiently closed related relatives. The proof of Hamilton's rule relies on certain non-trivial assumptions see Frank 1998, Grafen 1985, 2006, Queller 1992a, 1992b, Boyd and McIlreath 2006 and Birch forthcoming for details.

Though Hamilton himself did not use the term, his idea quickly became known as &lsquokin selection&rsquo, for obvious reasons. Kin selection theory predicts that animals are more likely to behave altruistically towards their relatives than towards unrelated members of their species. Moreover, it predicts that the степен of altruism will be greater, the closer the relationship. In the years since Hamilton's theory was devised, these predictions have been amply confirmed by empirical work. For example, in various bird species, it has been found that &lsquohelper&rsquo birds are much more likely to help relatives raise their young, than they are to help unrelated breeding pairs. Similarly, studies of Japanese macaques have shown that altruistic actions, such as defending others from attack, tend to be preferentially directed towards close kin. In most social insect species, a peculiarity of the genetic system known as &lsquohaplodiploidy&rsquo means that females on average share more genes with their sisters than with their own offspring. So a female may well be able to get more genes into the next generation by helping the queen reproduce, hence increasing the number of sisters she will have, rather than by having offspring of her own. Kin selection theory therefore provides a neat explanation of how sterility in the social insects may have evolved by Darwinian means. (Note, however, that the precise significance of haplodiploidy for the evolution of worker sterility is a controversial question see Maynard Smith and Szathmary 1995 ch.16, Gardner, Alpedrinha and West 2012.)

Kin selection theory is often presented as a triumph of the &lsquogene's-eye view of evolution&rsquo, which sees organic evolution as the result of competition among genes for increased representation in the gene-pool, and individual organisms as mere &lsquovehicles&rsquo that genes have constructed to aid their propagation (Dawkins 1976, 1982). The gene's eye-view is certainly the easiest way of understanding kin selection, and was employed by Hamilton himself in his 1964 papers. Altruism seems anomalous from the individual organism's point of view, but from the gene's point of view it makes good sense. A gene wants to maximize the number of copies of itself that are found in the next generation one way of doing that is to cause its host organism to behave altruistically towards other bearers of the gene, so long as the costs and benefits satisfy the Hamilton inequality. But interestingly, Hamilton showed that kin selection can also be understood from the organism's point of view. Though an altruistic behaviour which spreads by kin selection reduces the organism's personal fitness (by definition), it increases what Hamilton called the organism's инклузивна fitness. An organism's inclusive fitness is defined as its personal fitness, plus the sum of its weighted effects on the fitness of every other organism in the population, the weights determined by the coefficient of relationship r. Given this definition, natural selection will act to maximise the inclusive fitness of individuals in the population (Grafen 2006). Instead of thinking in terms of selfish genes trying to maximize their future representation in the gene-pool, we can think in terms of organisms trying to maximize their inclusive fitness. Most people find the &lsquogene's eye&rsquo approach to kin selection heuristically simpler than the inclusive fitness approach, but mathematically they are in fact equivalent (Michod 1982, Frank 1998, Boyd and McIlreath 2006, Grafen 2006).

Contrary to what is sometimes thought, kin selection does not require that animals must have the ability to discriminate relatives from non-relatives, less still to calculate coefficients of relationship. Many animals can in fact recognize their kin, often by smell, but kin selection can operate in the absence of such an ability. Hamilton's inequality can be satisfied so long as an animal behaves altruistically towards other animals that are Всушност its relatives. The animal може achieve this by having the ability to tell relatives from non-relatives, but this is not the only possibility. An alternative is to use some proximal indicator of kinship. For example, if an animal behaves altruistically towards those in its immediate vicinity, then the recipients of the altruism are likely to be relatives, given that relatives tend to live near each other. No ability to recognize kin is presupposed. Cuckoos exploit precisely this fact, free-riding on the innate tendency of birds to care for the young in their nests.

Another popular misconception is that kin selection theory is committed to &lsquogenetic determinism&rsquo, the idea that genes rigidly determine or control behaviour. Though some sociobiologists have made incautious remarks to this effect, evolutionary theories of behaviour, including kin selection, are not committed to it. So long as the behaviours in question have a genetical компонента, i.e. are influenced to some extent by one or more genetic factor, then the theories can apply. When Hamilton (1964) talks about a gene which &lsquocauses&rsquo altruism, this is really shorthand for a gene which increases the probability that its bearer will behave altruistically, to some degree. This is much weaker than saying that the behaviour is genetically &lsquodetermined&rsquo, and is quite compatible with the existence of strong environmental influences on the behaviour's expression. Kin selection theory does not deny the truism that all traits are affected by both genes and environment. Nor does it deny that many interesting animal behaviours are transmitted through non-genetical means, such as imitation and social learning (Avital and Jablonka 2000).

The importance of kinship for the evolution of altruism is very widely accepted today, on both theoretical and empirical grounds. However, kinship is really only a way of ensuring that altruists and recipients both carry copies of the altruistic gene, which is the fundamental requirement. If altruism is to evolve, it must be the case that the recipients of altruistic actions have a greater than average probability of being altruists themselves. Kin-directed altruism is the most obvious way of satisfying this condition, but there are other possibilities too (Hamilton 1975, Sober and Wilson 1998, Bowles and Gintis 2011, Gardner and West 2011). For example, if the gene that causes altruism also causes animals to favour a particular feeding ground (for whatever reason), then the required correlation between donor and recipient may be generated. It is this correlation, however brought about, that is necessary for altruism to evolve. This point was noted by Hamilton himself in the 1970s: he stressed that the coefficient of relationship of his 1964 papers should really be replaced with a more general correlation coefficient, which reflects the probability that altruist and recipient share genes, whether because of kinship or not (Hamilton 1970, 1972, 1975). This point is theoretically important, and has not always been recognized but in practice, kinship remains the most important source of statistical associations between altruists and recipients (Maynard Smith 1998, Okasha 2002, West et al. 2007).

2.1 A Simple Illustration: the Prisoner's dilemma

The fact that correlation between donor and recipient is the key to the evolution of altruism can be illustrated via a simple &lsquoone shot&rsquo Prisoner's dilemma game. Consider a large population of organisms who engage in a social interaction in pairs the interaction affects their biological fitness. Organisms are of two types: selfish (S) and altruistic (A). The latter engage in pro-social behaviour, thus benefiting their partner but at a cost to themselves the former do not. So in a mixed (S,A) pair, the selfish organism does better&mdashhe benefits from his partner's altruism without incurring any cost. However, (A,A) pairs do better than (S,S) pairs&mdashfor the former work as a co-operative unit, while the latter do not. The interaction thus has the form of a one-shot Prisoner's dilemma, familiar from game theory. Illustrative payoff values to each &lsquoplayer&rsquo, i.e., each partner in the interaction, measured in units of biological fitness, are shown in the matrix below.

Player 2
Altruist Selfish
Player 1 Altruist 11,11 0,20
Selfish 20,0 5,5
Payoffs for (Player 1, Player 2) in units of reproductive fitness

The question we are interested in is: which type will be favoured by selection? To make the analysis tractable, we make two simplifying assumptions: that reproduction is asexual, and that type is perfectly inherited, i.e., selfish (altruistic) organisms give rise to selfish (altruistic) offspring. Modulo these assumptions, the evolutionary dynamics can be determined very easily, simply by seeing whether the С или на А type has higher fitness, in the overall population. The fitness of the С тип, В(С), is the weighted average of the payoff to an С when partnered with an С and the payoff to an С when partnered with an А, where the weights are determined by the probability of having the partner in question. Затоа,

(The conditional probabilities in the above expression should be read as the probability of having a selfish (altruistic) partner, given that one is selfish oneself.)

Similarly, the fitness of the А type is:

From these expressions for the fitnesses of the two types of organism, we can immediately deduce that the altruistic type will only be favoured by selection if there is a statistical correlation between partners, i.e., if altruists have greater than random chance of being paired with other altruists, and similarly for selfish types. For suppose there is no such correlation&mdashas would be the case if the pairs were formed by random sampling from the population. Then, the probability of having a selfish partner would be the same for both С и А types, i.e., P(С partner/С) = P(С partner/А). Similarly, P(А partner/С) = P(А partner/А). From these probabilistic equalities, it follows immediately that В(С) is greater than В(А), as can be seen from the expressions for В(С) и В(А) above so the selfish type will be favoured by natural selection, and will increase in frequency every generation until all the altruists are eliminated from the population. Therefore, in the absence of correlation between partners, selfishness must win out (cf. Skyrms 1996). This confirms the point noted in section 2&mdashthat altruism can only evolve if there is a statistical tendency for the beneficiaries of altruistic actions to be altruists themselves.

If the correlation between partners is sufficiently strong, in this simple model, then it is possible for the condition В(А) > В(С) to be satisfied, and thus for altruism to evolve. The easiest way to see this is to suppose that the correlation is perfect, i.e., selfish types are always paired with other selfish types, and ditto for altruists, so P(С partner/С) = P(А partner/А) = 1. This assumption implies that В(А)=11 and В(С)=5, so altruism evolves. With intermediate degrees of correlation, it is also possible for the condition В(С) > В(А) to be satisfied, given the particular choice of payoff values in the model above.

This simple model also highlights the point made previously, that donor-recipient correlation, rather than genetic relatedness, is the key to the evolution of altruism. What is needed for altruism to evolve, in the model above, is for the probability of having a partner of the same type as oneself to be sufficiently larger than the probability of having a partner of opposite type this ensures that the recipients of altruism have a greater than random chance of being fellow altruists, i.e., donor-recipient correlation. Whether this correlation arises because partners tend to be relatives, or because altruists are able to seek out other altruists and choose them as partners, or for some other reason, makes no difference to the evolutionary dynamics, at least in this simple example.


3.2: Natural and un-natural groups - Biology

Graduate School of Pharmaceutical Science, Tokushima University

Graduate School of Pharmaceutical Science, Tokushima University

2018 Volume 66 Issue 2 Pages 132-138

  • Published: February 01, 2018 Received: August 29, 2017 Released on J-STAGE: February 01, 2018 Accepted: - Advance online publication: - Revised: -

(compatible with EndNote, Reference Manager, ProCite, RefWorks)

(compatible with BibDesk, LaTeX)

In this review, we have summarized the research effort into the development of unnatural base pairs beyond standard Watson–Crick (WC) base pairs for synthetic biology. Prior to introducing our research results, we present investigations by four outstanding groups in the field. Their research results demonstrate the importance of shape complementarity and stacking ability as well as hydrogen-bonding (H-bonding) patterns for unnatural base pairs. On the basis of this research background, we developed unnatural base pairs consisting of imidazo[5′,4′:4.5]pyrido[2,3-г]pyrimidines and 1,8-naphthyridines, т.е., Im : Na pairs. Since Im bases are recognized as ring-expanded purines and Na bases are recognized as ring-expanded pyrimidines, Im : Na pairs are expected to satisfy the criteria of shape complementarity and enhanced stacking ability. In addition, these pairs have four non-canonical H-bonds. Because of these preferable properties, ImN N : NaO O , one of the Im : Na pairs, is recognized as a complementary base pair in not only single nucleotide insertion, but also the PCR.

Recently, work by the Human Genome Project-Write, which focuses on synthesizing human genomes, has started. 1) Rewriting entire human genomes will deepen our understanding of the genetic code and have an impact on human health. In this manner, synthetic biology is a bottom-up-type research field that deals with the preparation of materials that comprise life systems. As only two base pairs have been selected during the evolution of life, т.е., adenine (A) : thymine (T) and guanine (G) : cytosine (C) pairs, these represent ideal genetic polymers. The specific formation of hydrogen bonds (H-bonds) in the A : T pair (two H-bonds) and G : C pair (three H-bonds) is the most fundamental rule of genetic information. In 1962, with surprising foresight, Rich proposed the possibility of an extra artificial base pair, т.е., isoguanine (isoG, 6-amino-2-oxopurine) and isocytosine (isoC, 2-amino-4-oxopurine), representing fifth and sixth DNA nucleobases. 2) The artificially designed isoG : isoC pair has three H-bonds with the specific proton donor (D) and proton acceptor (A) geometry [DDA : AAD], which is different from those in the A : T pair ([DA : AD]) and the G : C pair ([ADD : DAA]) (Fig. 1). If an extra base pair can function selectively in replication, transcription, and translation alongside natural Watson–Crick (WC) base pairs, it could potentially allow expansion of the genetic code. Thus, the creation of unnatural base pairs is a challenging and ideal research theme in synthetic biology. Herein, research into the development of unnatural base pairs and their applications are described.

Prior to presenting our unnatural base pair studies, the work of four famous and pioneering groups focusing on unnatural base pairs is introduced.

2.1. Unnatural Base Pairs with Non-standard H-Bonding Geometries Benner’s Group

In 1989, Benner and colleagues synthesized isoG и isoC nucleosides and their triphosphates with the goal of expanding the genetic alphabet 3) (Fig. 1). На isoG : isoC pair was recognized as a complementary base pair by polymerases both in ин витро replication and transcription systems. 4) They also designed other unnatural base pairs with different H-bonding patterns, such as the X : κ пар. 5) Additionally, they succeeded in incorporating the unnatural amino acid 3-iodotyrosine into a peptide by using a pair of 54-mer mRNA comprising isoC and tRNA with an isoGUC anticodon in ин витро translation systems. 6) These were the first studies to succeed in artificially rebuilding the central dogma using unnatural base pairs, indicating that the alteration of H-bonding geometries in base pairs is a promising strategy for creating a new unnatural base pairs. However, the selectivity of the isoG : isoC pair in enzymatic replication was unsatisfactory. Ова е затоа што isoG has a problem with tautomerism, in that the enol form of isoG has a [DAD] H-bonding pattern that is complementary to that of T. 4) In 2005, to address this drawback of isoG, they replaced natural T with 2-thioT (T s ). 7) Because of the bulkiness and H-bonding properties (weak proton acceptability) of the thione, T s is less likely to mispair with the tautomer of isoG than natural T. Fidelity per doubling of the isoG : isoC pair along with the A : T s pair in the PCR was improved by around 98%, although that with natural A : T was 93%. 7) However, when using an unnatural base pair with 98% replication fidelity, the retention of the unnatural base pair in its amplified DNA fragment after a 20-cycle PCR is decreased to 67% (т.е., 0.98 20 =ca. 0.67). Because the error rate for natural WC pairing in replication is ca. 10 −6 errors/bp, highly exclusive selectivity of unnatural base pairs is required. Thus, they also created another unnatural base pair comprising 2-aminoimidazo[1,2-а]-1,3,5-triazin-4(8Х)-one (П) and 6-amino-5-nitro-2(1Х)-pyridone (З). 8) The П : З pair, which has [AAD : DDA] H-bonding geometry, exhibits up to 99.8% fidelity per doubling without using the A : T s pair because, unlike isoG, З does not tautomerize. 9) Recently, they applied the six-letter genetic system with the П : З pair to the cell-systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) system and succeeded in obtaining highly active aptamers against HepG2 liver cancer cells. 10)

2.2. Non-hydrogen-Bonded Unnatural Base Pairs Kool’s Group

During the same decade as Benner’s pioneering works, Kool et al. have explored the possibility of non-H-bonded unnatural base pairs. In 1998, they created an unnatural base pair comprising 4-methylbenzimidazole (З) 11) and 2,4-difluorotoluene (Ф) as steric isosteres of the natural A : T pair 12,13) (Fig. 2A). Во еден ин витро replication system, З и Ф were equally replaced with natural A and T but not G and C, demonstrating the importance of shape complementary and stacking interactions in addition to H-bonding in base pairing. Additionally, they designed a modified З base, 9-methyl-1Х-imidazo[4,5-б]pyridine (Q), that has a proton acceptor corresponding to the N3 atom. 14) Because the incorporation efficiency of Q by Klenow fragment (KF) DNA polymerase is superior to that of З, the importance of proton acceptors in the minor groove for unnatural base pair design is also demonstrated.

To further evaluate the importance of shape complementarity in base pairing, they also created size-expanded (benzo-fused) WC-like base pairs, such as xA : T and A : xT pairs (termed xDNA), that have the same H-bonding geometry as natural WC base pairs but with their pairing edges shifted outward by 2.4 Å (т.е., the width of benzene) 15,16) (Fig. 2B). KF polymerase incorporated natural nucleoside triphosphate (dNTP) opposite xDNA bases in a DNA template with an efficiency ca. 1000-fold lower than that of natural pairs, 16) and endogenous Ешерихија коли (Ешерихија коли) enzymes accurately transcribed xDNA to encode the bacteria phenotype. 17)

2.3. Creation of a Semi-synthetic Organism with an Unnatural Base Pair Romesberg’s Group

Romesberg and colleagues have also developed various kinds of non-H-bonded unnatural base pairs. In 1999, they reported the self-complementary 7-propynylisocarbostyril (PICS) : PICS pair 18) (Fig. 3). Кога PICS : PICS base pairs are incorporated into DNA, the resulting duplex shows high thermal stability, and KF polymerase recognizes the PICS : PICS pair as a complementary base pair. However, further replication reactions after PICS : PICS base pairing are terminated because PICS bases overlap with each other, indicating structural change in the DNA duplex. Consequently, they explored more than 100 kinds of unnatural base pairs 19–25) and succeeded in developing 5SICS : MMO2 и 5SICS : NaM pairs, which are replicable unnatural base pairs in the PCR. 26–28) In 2014, they reported the creation of a semi-synthetic organism containing the 5SICS : NaM base pair. In this work, an exogenously expressed nucleoside triphosphate transporter imported d5SICS and dNaM triphosphates efficiently into Ешерихија коли, and an endogenous replication system used them in the genetic codes. 29) This report had a great impact on synthetic biology, and some researchers consider the created organism to be “alien.”

2.4. Unnatural Base Pair as a Powerful Tool for Creating Highly Functional Nucleic Acids Hirao’s Group

Hirao et al. have also focused on the creation of unnatural base pairs that function in replication, transcription, and translation in the same way as natural WC base pairs. Their unnatural base pairs were developed by exploiting the concept of steric hindrance. In their 2-amino-6-(2-thienyl)purine (с) : 2-oxo-1Х-pyridine (y) pair, the purine-like с has a bulky substituent at the major groove side 30,31) (Fig. 4). Така, на с : y pair is selectively recognized as a complementary base pair by KF polymerase in ин витро replication systems. Furthermore, in 2002 they succeeded in synthesizing the Ras protein modified with 3-iodotyrosine from a DNA template containing the с base by combining T7 polymerase transcription and Ешерихија коли ин витро translation systems. 32) They also developed the Ds : Pa base pair, in which H-bonding atoms and substituents located at the base-pairing side are excluded. 33) The replication selectivity of the Ds : Pa pair is superior to that of the с : y pair, and the Ds : Pa pair can be amplified in the PCR with over 99% fidelity per doubling using γ-amino triphosphates of Ds and A. 33) Concerning selectivity in replication, their unnatural base pairs exhibit the best performances among the reported unnatural base pairs. The low misincorporation rate of the recently developed Ds : diol1-Px pair (5×10 −5 errors/bp) is close to the mispairing error rate of natural WC pairs (2×10 −5 errors/bp). 34,35) By making use of this superior property of the Ds : diol1-Px pair, they succeeded in obtaining a DNA aptamer containing the Ds base against human protein target, vascular endothelial cell growth factor-165 (VEGF-165). 36) Because the affinities of aptamers that have Ds bases are >100-fold improved over those of aptamers containing only natural bases, the potential of genetic alphabet expansion as a powerful tool for creating highly functional nucleic acids is demonstrated.

In contrast to the research described above, we began our unnatural base pair studies to address the simple question : why did WC base pairs come to contain two or three H-bonds during the evolution of life? To answer this, we have explored four H-bonding base pairs. 37–41) As purine-type nucleobases, a series of imidazo[5′,4′:4.5]pyrido[2,3-г]pyrimidines (Im) were designed, 37) while 1,8-naphthyridines (Na) were designed as their complementary pyrimidine nucleobases. 38) For the first generation of our four-H-bonding unnatural base pairs, two Im : Na pairs, т.е., ImN O : NaO N и ImO N : NaN O , which have alternate H-bonding geometries, were developed. As can be seen in Fig. 5a, these pairs have four non-canonical H-bonds and expanded aromatic surfaces, and they satisfy the shape complementarity criterion like WC base pairs. Because of the contributions of these effects, DNA duplexes containing these pair(s) are significantly thermally stabilized (ca. +8°C/pair). 38) In addition, both pairs are recognized by KF polymerase as complementary in single nucleotide insertion. However, the kinetic parameters determined for their 5′-triphosphates revealed that the efficiencies of incorporation for ImN O : NaO N и ImO N : NaN O pairs are 1–2 orders of magnitude lower than those of natural A : T and G : C pairs. Furthermore, misincorporation of natural dNTP, for example, that of 2′-deoxyadenosine 5′-triphosphate (dATP) against NaN O in the template was clearly observed at the same efficiency as that of ImO N TP против NaN O in the template owing to the possible formation of an A : NaN O pair with two H-bonds 42,43) (Fig. 5b).

To improve efficiency and selectivity, a new Im : Na pair, т.е., ImN N : NaO O , has been envisioned 39,44) (Fig. 5c). This pair has a [DAAD : ADDA] H-bonding geometry, and thus is expected to avoid the misincorporation of natural A and G (Fig. 5d). The chemistry and enzymatic behavior of the ImN N : NaO O pair is described below.

3.1. Synthesis of the Nucleoside Units for the ImN N : NaO O Pair

The most straightforward synthesis of ImN N nucleoside 1 is thought to be through intramolecular cyclization of the 5-pyrimidinylimidazole nucleoside, which can be prepared преку Stille coupling between the 5-iodoimidazole nucleoside 2 and (tributylstannyl)pyrimidine 3 (Chart 1). When a mixture of 2 prepared from 2′-deoxyinosine and 3 prepared from 2,4-dichloropyrimidine is heated in Н,Н-dimethylformamide (DMF) in the presence of tris(dibenzylideneacetone)dipalladium(0)-chloroform adduct (dba3Pd2·CHCl3), a mixture of coupling product 4 and a spontaneously cyclized tricyclic product 5 is obtained. Subsequent treatment of the mixture under basic conditions converges the mixture to the tricyclic product 5. Finally, treatment of 5 with a mixture of 1,4-dioxane and NH4OH gives the desired ImN N nucleoside 1 in good yield. 37) The resulting 1 is then converted into the corresponding phosphoramidite unit and 5′-triphosphate under the appropriate conditions. 44,45)

Reagents and conditions: (a) dba3Pd2·CHCl3, DMF, 100°C (b) Na2CO3, aq. EtOH, 80°C (c) NH4OH/1,4-dioxane, 100°C.

For the synthesis of NaO O nucleoside 6, which is an unusual C-nucleoside, the palladium-catalyzed Heck reaction was envisioned. As illustrated in Chart 2, 3-iodo-1,8-naphthyridine derivative 7 prepared from 2-amino-7-hydroxy-1,8-naphthyridine and glycal 8 are prepared. Then, Heck coupling of 7 со 8 in the presence of palladium acetate and triphenylarsine followed by deprotection and stereoselective reduction affords 1,8-naphthyridine C-nucleoside 9. After protection of the hydroxyl groups with silyl groups to give 10, the substituent at the 2-position is converted into an acetoxy group преку 11. Finally, treatment of the resulting 12 with methanolic ammonia at 60°C in a sealed tube gives the desired NaO O nucleoside 6 in good yield. In a similar manner as for 1, 6 is converted into the corresponding phosphoramidite unit and 5′-triphosphate for enzymatic evaluation. 39,45)

Reagents and conditions: (a) Pd(OAc)2, AsPh3, Bu3N, DMF, 60°C (b) TBAF, THF (c) NaBH(OAc)3, AcOH, CH3CN (d) TIPSCl, imidazole, DMF, 55°C (e) NH3/MeOH, 80°C (f) NaNO2, AcOH (g) NH3/MeOH, 80°C.

3.2. Investigation of Single Nucleotide Insertion with the ImN N : NaO O Pair

To investigate the efficiency and selectivity of the newly designed ImN N : NaO O pair in ин витро replication systems, we examined single nucleotide insertion using KF polymerase, and the kinetic parameters, such as the Michaelis constant (Км), the maximum rate of the enzyme reaction (Вмакс), and the incorporation efficiency (Вмакс/Км), for the ImN N : NaO O pair were determined and compared with those of the two previous Im : Na pairs 45) (Fig. 6). As discussed above, the values of Вмакс/Км за ImN O : NaO N pair are 1–2 orders of magnitude lower than those of the natural A : T pair (6.0×10 7 –9.0×10 7 % min −1 M −1 ), as presented in the first row of Fig. 6. This result is thought to be due to the fact that the NaO N base lacks a proton acceptor corresponding to the O2 atom of the natural pyrimidine base. За ImO N : NaN O pair, the Вмакс/Км values are better than those for the ImN O : NaO N pair (second row in Fig. 6). However, as well as the desired ImO N , undesired A is incorporated against NaN O in the template with a comparable Вмакс/Км value (Fig. 5b).

a) Incorporation of dYTP against a series of Im bases in the template. b) Incorporation of dYTP against a series of Na bases in the template. a n.d.=not determined.

Concerning incorporation efficiencies, the Вмакс/Км values for the ImN N : NaO O pair are superior to those for the ImN O : NaO N и ImO N : NaN O pairs because the ImN N и NaO O bases have proton acceptors at positions corresponding to the N3 of a purine and the O2 of a pyrimidine, respectively. Покрај тоа, на ImN N : NaO O pair has higher thermal stability than the two previous Im : Na pairs owing to the [DAAD : ADDA] H-bonding pattern. 39) The preferable base-pairing properties of the ImN N : NaO O pair lead to it having the highest incorporation efficiency among the three Im : Na pairs. With respect to specificity, misincorporations of natural A and/or G against ImN N in the template are controlled by the [DAAD : ADDA] H-bonding pattern of the ImN N : NaO O пар. The efficiency of ImN N TP incorporation against NaO O is at least ten-times higher than those of natural dATP and 2′-deoxyguanosine 5′-triphosphate (dGTP) incorporations. Thus, as expected from Fig. 5d, formation of both A : NaO O and G : NaO O should be negligible owing to the NH proton repulsion between the 6-amino group of A and N8 of NaO O , and that between N1 of G and N1 of NaO O , соодветно.

3.3. PCR Amplification with ImN N : NaO O Pair

To apply the newly developed ImN N : NaO O pair to synthetic biology research like that reported by the four aforementioned groups, this pair should be viable in PCR amplification. Thus, according to the method reported by Hirao et al., 34) PCR involving the ImN N : NaO O pair was examined under various dNTP conditions (Fig. 7a).

(a) Schematics of the template and primers, and the resulting amplicon. Gel electrophoresis of PCR products obtained using Taq DNA polymerase (b), Deep Vent exo − DNA polymerase (c), Deep Vent exo + DNA polymerase (d), and Pfx 50 DNA polymerase (e) under different dNTP conditions.

First, when Taq DNA polymerase, which is a standard thermophilic DNA polymerase for routine PCR, is used, a 75 base-pair amplicon in the presence of ImN N TP and NaO O TP along with all four kinds of dNTPs is successfully obtained (Fig. 7b, lane 4). However, similar PCR products are observed under the conditions lacking ImN N TP (lane 3), indicating that inaccurate amplification occurs, presumably owing to misincorporation of natural A and/or G against NaO O in the resulting DNA fragment. Thus, we screened suitable thermophilic DNA polymerases, and typical results are shown in Figs. 7c–e. Exonuclease-deficient Deep Vent (Deep Vent exo − ) DNA polymerase gives the full-length amplicon in both the presence and absence of NaO O TP (Fig. 7c). Conversely, the same polymerase with 3′→5′ exonuclease activity (Deep Vent exo + ) preferentially affords the PCR product in the presence of all 5′-triphosphates (Fig. 7d), suggesting that the proofreading activity identifies mismatched base pairs with natural nucleobases and corrects them to the ImN N : NaO O пар. It has been reported that the proofreading activity of DNA polymerases improves the accuracy of incorporating unnatural base pair analogs, 32,33) and the benefits of this activity are apparent in our case.

To further evaluate the fidelity of the ImN N : NaO O pair in PCR amplification, we sequenced the resulting PCR product according to methods reported by the groups of Benner 26) and Hirao. 34) As a result, the lowest total mutation rates of the ImN N : NaO O pair is observed when using Pfx 50 DNA polymerase, and it is estimated to be ca. 6% after 15 PCR cycles (fidelity ≈0.995 per doubling) (the analysis of PCR products by gel electrophoresis is shown in Fig. 7d). Although the replication fidelity of the ImN N : NaO O pair is slightly inferior to those of other unnatural base-pair analogs, 8,9,26,28,34,46,47) it is strongly indicated that the ImN N : NaO O pair acts as an orthogonal base pair for WC base pairs during PCR amplification.


Погледнете го видеото: Bioloģijas video (Август 2022).