Информации

Што ја одредува реверзибилноста на клетката од фазата G0 во клеточниот циклус?

Што ја одредува реверзибилноста на клетката од фазата G0 во клеточниот циклус?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Од Вајнберг Биологија на ракот: Клетката која неодамна е формирана со митоза мора да одлучи дали повторно ќе иницира нов круг на активен раст и поделба или ќе се повлече во нерастечка состојба G0. Оваа одлука е под силно влијание на митогените фактори на раст во околината на клетката. Нивното отсуство или присуство на анти-митогени фактори на раст ќе ја поттикне стандардната одлука да се премине од митоза во состојба на мирување G0. Повлекувањето од клеточниот циклус во G0 е често реверзибилно (клетката може повторно да влезе во активен раст и делба), но некои клетки неповратно го напуштаат клеточниот циклус (како што се невроните).

Еве го моето прашање: Што одредува во ќелијата дали ќелијата ќе оди во реверзибилна (мирна) или неповратна (старечка) состојба на G0? Открив дека има врска со количината на РНК (ниска содржина на РНК во реверзибилна), но не разбирам зошто ниската содржина на РНК значи дека клетката треба повторно да се размножува. И дали има некои други критериуми кои одредуваат дали клетката ќе оди во мирна или неповратна состојба? (Барам точни молекули и механизми, колку подетално толку подобро!)


Одговорот е доста комплициран. Едно од главните прашања во разбирањето кои фактори го поттикнуваат стареењето наспроти тишината е отсуството на јасна, униформа молекуларна дефиниција за стареење. Сепак, повеќекратните супресори на тумор, вклучително и p16 (и другите гени кои го окупираат локусот INK/ARF), како и TP53, можат да го модулираат изразот на транскрипционите програми поврзани со стареење.

Дополнително, познато е дека епигенетското ремоделирање, вклучително и хетерохроматизацијата на целните гени E2F (кои се главен двигател на прогресијата на клеточниот циклус низ S фазите) е карактеристика на стареењето.

Многу добра почетна точка за истражување на литературата околу темата е https://www.nature.com/articles/nrc3960?message-global=remove


Што ја одредува реверзибилноста на клетката од фазата G0 во клеточниот циклус? - Биологија

Прегнане Х рецепторот (PXR) е важен транскрипциски регулатор кој игра важна улога во клеточниот метаболизам и клеточниот раст преку регулирање на транскрипцијата на еден вид метаболизирачки ензими.

Цел

За да се испита дали рифампицинот влијаел на растот на клетките на HepG2 и инхибицијата се должи на прекинот на фазата G0/G1.

Методи

Експериментите со PXR-нокдаун користејќи RNAi покажаа дека прекинот на фазата на клеточниот циклус е посредуван од рифампицин врз основа на активирање на PXR. Резултатите исто така покажаа дека прекинот на клеточната фаза од рифампицин може да ги заштити клетките од оштетување на ДНК предизвикано од УВБ. Нивото на експресија на ретиноидниот X рецептор алфа (RXRα) во клетките е уште еден клучен фактор за прекин на фазата на клеточниот циклус со посредство на рифампицин. И прекумерната експресија и недостатокот на изразување на RXRα во клетката ја намалија ефикасноста на апсењето на клетките посредувана од рифампицин. Во студијата, откривме дека рифампицинот го инхибира растот на клетките на HepG2 и покажа дека инхибицијата се должи на прекинот на фазата G0/G1 преку анализа на цитометрија на проток.

Заклучок

Резултатите покажаа дека RXRα ја промовира стапката на транзиција на фазата на клеточниот циклус на HepG2. Конкурентното поврзување на PXR активиран од рифампицин со RXRα е една од главните причини за запирање на фазата на клеточниот циклус преку инхибиција на комбинацијата на RXRα со други партнери. Рифампицинот може да ја промовира стапката на клеточен раст кога RXRα се изразува попрекумерно од PXR во клетките.


Вовед

Оската на ангиотензин-конвертирачки ензим 2 (ACE2)/ангиотензин-(1-7)/Mas е добро познат контрарегулаторен пат во системот ренин-ангиотензин (RAS) 1 . Во оваа оска, ангиотензин-(1-7) се произведува од ангиотензин I или ангиотензин II преку каталитичката активност на ACE2, ACE хомолог, а концентрациите на имунореактивниот ангиотензин-(1-7) во човечката плазма се пријавени дека се 1,0- 9,5 pmol/L 2. Постојат многу докази за ендотелијалните заштитни ефекти на оската на ACE2/ангиотензин-(1-7)/Mas рецепторот. Оваа оска е неодамна откриен пат кој може да ги промени ефектите на Ангиотензин II во голем број ткива, главно со инхибиција на растот на клетките, миграцијата и воспалението што се јавува како резултат на активноста на Ангиотензин II, спречувајќи негативно ремоделирање и последователна дисфункција на кардиоваскуларен систем 1,3,4,5,6,7. Хроничната инфузија на ангиотензин-(1-7) исто така беше индицирана за подобрување на бубрежната ендотелијална функција преку зголемување на ендогениот азотен оксид кај глувците со дефицит на аполипопротеин Е 8 . Спротивно на тоа, нокаутот на рецепторот на ангиотензин-(1-7) Mas предизвикува ендотелијална дисфункција кај C57Bl/6 глувци 9 . Неодамна, исто така објавивме дека третманот со ангиотензин-(1-7) може значително да го ублажи производството на ендотелијален интерлеукин-6 индуцирано од гликозиран албумин 10 . Земени заедно, овие резултати сугерираат дека засилувањето на ACE2/ангиотензин-(1-7)/Mas обезбедува заштита од развој на ендотелијална дисфункција. Сепак, доминантното влијание на акутниот третман со ангиотензин-(1-7) врз ендотелијалните клетки останува нејасно.

Квантитативната протеомика е важна гранка на протеомика која се користи за квантифицирање и идентификување на сите протеини изразени во геном или во сложена смеса. Изобарните ознаки за релативна и апсолутна квантификација (iTRAQ) беа развиени во 2004 година од Рос et al. Овој уникатен пристап ги означува примероците со четири независни изобарични ознаки со иста маса и, по фрагментација во тандемската масена спектрометрија (MS/MS), техниката произведува четири уникатни известувачки јони (m/z од 114 до 117) кои обезбедуваат квантитативни информации врз основа на интеграцијата на врвните области на четирите различни примероци 11 . Напредната комбинација на протеомика и биоинформатика дава погодна можност за проучување на примарните промени во глобалниот протеом, како што се нивоата на молекуларна експресија во клетките во кое било време или за кој било третман. Со развојот на биоинформатиката, има повеќе студии кои користат квантитативни протеомски платформи без гел за да ги истражат променливите и сложените физиолошки процеси 12,13,14.

Кофилин-1 е протеин од 19 kDa кој е сеприсутен присутен кај еукариотите и ја промовира динамиката на филаментот на актин за време на подвижноста, развојот и цитокинезата 15 . Кофилин-1 е член на семејството ADF/Cofilin. Ова семејство има три члена: Кофилин-1 (CFL1, не-мускулен кофилин), Кофилин-2 (CFL2, мускулен кофилин) и ADF (десрин) 16 . Кофилин-1 е главниот протеин, а неговата регулација е пријавена дека е поврзана со различни видови на рак 17,18,19. Во 2013 година, Јанг et al. исто така предложи Кофилин-1 е нов биомаркер за лоша прогноза на рак на жолчното кесе 20 . Сепак, дали нивоата на изразување на Кофилин-1 се важни за регулирање на клеточниот циклус и прогресијата на автофагијата во човечките аортни ендотелијални клетки (ХАЕК) сè уште е нејасно.

Ја користевме iTRAQ анализата за квантитативно профилирање на протеинската експресија на HAEC како одговор на третманот со ангиотензин-(1-7) за 6 часа. Протеинот Cofilin-1 беше идентификуван како уникатен кандидат од дуплицираната iTRAQ анализа која покажа поголема покриеност (>30%) и конзистентна прекумерна експресија (>1,2 пати) во ендотелните клетки третирани со ангиотензин (1-7) отколку во нетретирани клетки. Врз основа на серија молекуларни биолошки валидации, Кофилин-1 беше идентификуван како регулатор на прекин на клеточниот циклус, автофагија и апоптоза кај HAEC за прв пат. Оваа студија го унапредува нашето разбирање на улогата на Кофилин-1 во HAEC хомеостазата под оската ACE2/ангиотензин-(1-7)/Mas.


Запирање на клеточниот циклус предизвикано од симвастатин преку инхибиција на оската STAT3/SKP2 и активирање на AMPK за промовирање на акумулација на p27 и p21 во клетките на хепатоцелуларниот карцином

Хепатоцелуларниот карцином (HCC) се карактеризира со лоша прогноза и е една од водечките причини за смрт поврзана со рак ширум светот. Симвастатин, инхибитор на HMG-CoA редуктаза, кој ја намалува синтезата на холестерол преку инхибиција на мевалонатните патишта и широко се користи за лекување на кардиоваскуларни болести. Симвастатин покажува антиканцерогени ефекти против неколку малигни тумори. Сепак, молекуларните механизми кои се во основата на антиканцерогените ефекти на симвастатин врз HCC сè уште не се добро разбрани. Во оваа студија, демонстриравме прекин на G0/G1 индуциран од симвастатин со индуцирање на акумулација на p21 и p27 во клетките HepG2 и Hep3B. Симвастатин, исто така, промовираше активирање на AMP-активирана протеинска киназа (AMPK), што предизвика регулација на p21 со зголемување на неговата транскрипција. Во согласност со ова откритие, откривме генетско замолчување на AMPK намалена експресија на p21, меѓутоа, замолчувањето на AMPK немаше ефект врз изразувањето на p27 во HCC клетките. Симвастатин ја намали експресијата на Skp2 на ниво на транскрипција, што резултираше со акумулација на p27 со спречување на протеазомална деградација, ефект посредуван од сигнален трансдуцер и активатор на инхибиција на транскрипцијата 3 (STAT3). Конститутивната активација на STAT3 одржува изразување на високо ниво на Skp2 и изразување на пониско ниво на p27 и значително го спречи прекинот на G0/G1 во HCC клетките третирани со симвастатин. Мевалонатот ја намали активацијата на АМПК предизвикана од симвастатин и ја спаси експресијата на фосфо-STAT3 и Skp2 во HCC клетките, што резултираше со спречување на прекин на G0/G1 преку инхибиција на акумулацијата на p21 и p27. Покрај тоа, симвастатин значително го намали растот на туморот кај глувците со ксенографт HepG2. Доследно, откривме дека симвастатин исто така ја зголемува експресијата на p21 и p27 во туморските делови со намалување на експресијата на Skp2 и поттикнување на активирање на АМПК и супресија на STAT3 во истите туморски ткива. Земени заедно, овие наоди се демонстративни за постоењето на нов пат во кој симвастатин индуцира прекин на G0/G1 преку регулација на p21 и p27 преку активирање на AMPK и инхибиција на оската STAT3-Skp2, соодветно. Резултатите идентификуваат нови цели кои ги објаснуваат корисните антиканцерогени ефекти на третманот со симвастатин врз HCC in vitro и in vivo.

Изјава за конфликт на интереси

Авторите изјавуваат дека нема конфликт на интереси.

Фигури

Симвастатин индуцира зависни од p21 и p27…

Симвастатин предизвикува прекин на клеточниот циклус G0/G1 зависен од p21 и p27 во клеточните линии на HCC.…

Протеинот p21 и p27 индуциран од симвастатин…

Урегулацијата на протеините p21 и p27 индуцирана од симвастатин беше поврзана со транскрипциска активација и протеин…

Активирање на АМПК индуцирано од симвастатин и p21…

Активирањето на АМПК индуцирано од симвастатин и регулацијата на p21 делумно предизвикаа прекин на G0/G1 во клетките HepG2.…

Нагорната регулација на p27 индуцирана од симвастатин беше зависна од Skp2…

Регулацијата на p27 индуцирана од симвастатин беше зависна од Skp2 и промовираше прекин на клеточниот циклус на фазата G0/G1 во…

STAT3C мутантите ја одржуваа експресијата на Skp2…

STAT3C мутантите ја одржуваа експресијата на Skp2 за да спречат акумулација на p27 и клеточен циклус G0/G1…

Егзогениот мевалонат ја потиснува инхибиторната…

Егзогениот мевалонат ги потиснува инхибиторните ефекти на симвастатинот врз растот на клетките со враќање на ...

Симвастатин го инхибира растот на туморот на HepG2…

Симвастатин го инхибира растот на туморот на HepG2 кај ксенографт глувци. Голи глувци BALB/c кои носат тумор на HepG2…


Клеточен циклус кај ракот

Клеточниот циклус, процесот со кој клетките напредуваат и се делат, лежи во срцето на ракот. Во нормалните клетки, клеточниот циклус е контролиран од сложена серија на сигнални патишта преку кои клетката расте, ја реплицира нејзината ДНК и се дели. Овој процес вклучува и механизми за да се осигура дека грешките се коригираат, а ако не, клетките извршуваат самоубиство (апоптоза). Кај ракот, како резултат на генетски мутации, овој регулаторен процес не функционира, што резултира со неконтролирана клеточна пролиферација.

Програмите за откривање и развој на лекови на Cyclacel Pharmaceuticals се базираат на научниот напредок во разбирањето на овие молекуларни механизми. Преку нашата експертиза, развиваме терапии за рак засновани на клеточен циклус, насочени кон механизми, кои го имитираат природниот процес на телото со цел да го запреме растот на клетките на ракот. Овој пристап може да го ограничи оштетувањето на нормалните клетки и придружните несакани ефекти предизвикани од конвенционалните хемотерапевтски агенси.

Професорите Сер Дејвид Лејн и Дејвид Гловер, двајца од нашите клучни научници, имаат воспоставено водечка позиција во откривањето и развојот на лекови од клеточниот циклус. Сер Дејвид го откри протеинот p53, клучен регулаторен ген кој неправилно функционира кај околу две третини од пациентите со рак. Дејвид Гловер откри неколку гени (Аурора и Поло кинази) кои ја поттикнуваат митозата и кои во мутирана форма се поврзани со многу видови на рак.

Биологија на клеточниот циклус

  1. фазата G1, или јазот, во која клетката расте и се подготвува да синтетизира ДНК
  2. S, или фазата на синтеза, во која клетката синтетизира ДНК
  3. фазата G2, или вториот јаз, во која клетката се подготвува да се подели и
  4. фазата М, или митоза, во која се јавува клеточната делба.

Втор таков контролен пункт се јавува во фазата G2 по синтезата на ДНК во S фазата, но пред клеточната делба во M фазата. Клетките користат комплексен сет на ензими наречени кинази за да контролираат различни чекори во клеточниот циклус. Киназите зависни од циклин, или ЦДК, се специфично ензимско семејство кое користи сигнали за вклучување на механизмите на клеточниот циклус. Самите ЦДК се активираат со формирање на комплекси со циклини, друга група на регулаторни протеини присутни само за кратки периоди во клеточниот циклус. Кога функционираат правилно, регулаторните протеини на клеточниот циклус делуваат како сопствени супресори на туморот на телото со контролирање на растот на клетките и поттикнување на смртта на оштетените клетки. Генетските мутации кои предизвикуваат неправилно функционирање или отсуство на еден или повеќе од регулаторните протеини на контролните точки на клеточниот циклус може да резултираат со „молекуларниот прекинувач“ да биде трајно вклучен, дозволувајќи неконтролирано размножување на клетката, што доведува до канцерогенеза или развој на тумор.


Дискусија

iPS-клетките обезбедуваат единствена платформа за проучување на молекуларните механизми на плурипотенција и нуклеарно репрограмирање. Меѓутоа, во споредба со клетките на глувчето, процесот на репрограмирање на човечки соматски клетки одзема повеќе време и помалку ефикасен. И покрај тоа што е добро утврдено дека процесот на репрограмирање би вклучувал епигенетско и метаболичко ремоделирање, молекуларната регулација која лежи во основата на репрограмирањето сè уште останува во голема мера мистериозна [30].

Неодамна, неколку мали молекули беа пријавени за подобрување на репрограмирањето или замена за факторите за репрограмирање. Овие хемикалии имаат позитивни ефекти преку епигенетски модификации или патишта за трансдукција на сигналот. Сепак, неопходно е ригорозно да се тестираат и несаканите ефекти. Некои модификации генерирани од хемикалии може да резултираат со генетски аберации и генска дисрегулација [31].

Клеточната делба е клучен параметар за придвижување на епигенетското репрограмирање до плурипотенција. Инхибицијата на патеката P53/P21 или прекумерната експресија на Lin28 ја зголемува стапката на клеточна делба и ја забрзува кинетиката на формирањето на iPSCs [32]. Неодамнешен извештај покажа дека високата стапка на пролиферација е ран настан во репрограмирањето, додека прекинот на клеточниот циклус со p15, p16 или p21 го инхибира репрограмирањето индуцирано од ретровирус [33]. Забрзаната клеточна делба би можела да го засили бројот на целни клетки во кои секоја клетка ќерка има независна веројатност да стане iPSC, или репликацијата на ДНК може да биде предуслов за да се дозволат епигенетските промени, како што се модификациите на хистонот, за да се овозможи транзиција кон плурипотенција [30 ]. Овие студии обезбедија убедливи докази дека молекуларните настани во раниот клеточен циклус за време на репрограмирањето може да играат клучна улога во постигнувањето на плурипотенција.

Добро е познато дека ефикасната трансдукција на факторите за репрограмирање е од суштинско значење за плурипотенција. Со користење на докс-индуциран трансгенски систем, се покажа дека процесот на репрограмирање бара 10-12 дена одржлива трансгенска експресија за да се активираат маркерите на плурипотенција [34]. Недоволна инфекција со парцијални фактори, на пример, само со Oct4 и c-Myc, обично резултира со делумно репрограмирање [11]. Во оваа студија, покажавме дека синхронизацијата генерира реверзибилно запирање на клеточниот циклус на G0/G1 и постигна совпаѓачки ритам на клеточниот циклус, што ја зголеми ефикасноста на инфекцијата. Врз основа на овој протокол, значително ја подобривме ефикасноста на репрограмирање на 1,4% во HDF и 2,6% во ASC (Nanog позитивни клонови, Слика 3F, Табела S1). Оваа стратегија за синхронизација може да се користи и за промовирање на трансгенска експресија со посредство на ретровирус во други истражувачки контексти.

За време на процесот на репрограмирање, целните клетки претрпуваат драматична морфолошка промена од мезенхимален фенотип до епителијална карактеристика слична на ES [35]. MET исто така се смета за белег на почетната фаза и неопходен за репрограмирање [29], [36]. Забележано е дека BMP сигнализацијата се синергира со OSKM за промовирање на MET [37]. Интересно, нашите резултати покажаа дека синхронизираните HDF и ASC покажаа униформа MET по инфекцијата и го олеснија човечкото соматско репрограмирање. Можното толкување е дека синхронизираните клетки (пред фазата G2/M) имаат тенденција да бидат инфицирани од ретровирусите, што доведува до поефикасно изразување на трансгените. Покрај тоа, синхронизацијата создава можност за истовремена инфекција во повеќето клетки, проследена со синхронизирано изразување на факторите за репрограмирање во поединечни клетки. Конечно, одредена авто- или меѓуклеточна регулација по синхронизирана експресија на трансгени може да предизвика хомологна МЕТ и да насочи кон плурипотенција.

Тешко е да се разликува целосно и делумно репрограмирање со помош на клеточна морфологија, бидејќи парцијалните клонови се многу побројни од оние слични на ES. Пријавено е дека репрограмирањето е стохастички процес, а повеќето заразени клетки биле заробени во делумно репрограмирана состојба поради неможноста да се надмине епигенетската бариера [4]. Така, детално проучување на транскрипциското и епигенетското ресетирање е од суштинско значење за да се исклучи делумното репрограмирање. Во соматските клетки, промоторите на Oct4 и Nanog се високо метилирани, што ја одразува репресијата на транскрипциско ниво. Нашите резултати открија дека синхронизираните HDF и ASC добиени iPSC покажаа висока деметилација во Oct4 и Nanog промотерските региони.

Бидејќи човечкиот iPSC е сличен на ESC, го избравме EB изведен од ESC како контрола за тестирање на способноста за диференцијација на iPSC, како што беше претходно опишано [7], [38]. Откривме дека изразот на Pax6 и Sox17 (освен во GATA6) беше помал од ES-EB, иако сите избрани iPSC линии во нашата студија можат да генерираат тератом, златен стандард на плурипотенција [39]. Овие резултати се во согласност со претходниот заклучок дека човечкиот iPSC е сличен, но не е идентичен со ESC [1]. Исто така е прифатливо дека iPSC има тенденција да се редиференцира во добиените донорски клетки [40], [41], како што е прикажано во нашите резултати (слика 5 Б) беше откриен релативно повисок израз на GATA6. Претходните резултати, исто така, покажаа нееднакви нивоа на изразување во различни линии iPSC по диференцијацијата [7], [38], [42].

Како заклучок, нашите резултати обезбедуваат директен доказ дека синхронизацијата на клеточниот циклус во голема мера ја промовира MET и ефикасноста на репрограмирање без потреба од дополнителни хемикалии. Нашите наоди нудат нови сознанија за процесот на репрограмирање и ќе бидат корисни за ефикасното генерирање iPSC специфични за болеста.


Резултати

Прекумерната експресија на MPS-1 е откриена во трансфицираните UMSCC-1 туморски клетки и условениот медиум

За да се испита дали прекумерната експресија на MPS-1 може да влијае на растот на клетките на туморот, како прв чекор, UMSCC-1 клетките на сквамозен карцином на главата и вратот беа трансфектирани со кој било плазмид што содржи cDNA за MPS-1 означена со His(6) на C - терминал или контролна плазмида. По неколку сортирање на клетки со цитометрија на проток, повеќе од 95% од клетките изразија EGFP. Клеточните лизати беа анализирани со Western blotting, што потврди дека MPS-1 протеинот е високо изразен во UMSCC-1/MPS-1 клетките во споредба со UMSCC-1/контролните клетки (сл. 1а). За да ја одредиме субклеточната локација на MPS-1, го проверивме присуството на MPS-1 во екстракцијата на цитозол и нуклеарната екстракција. Откри дека MPS-1 не е само цитозолен протеин, туку и нуклеарен протеин (сл. 1б). Понатаму, анализата со дамки со точки на условениот медиум од култивираните клетки покажа дека MPS-1 протеинот со His ознака се секретира во условената средина од UMSCC-1/MPS-1 клеточна култура (сл. 1в), што е во согласност со нашите претходни наоди дека MPS-1 може квантитативно да се открие во серумот од пациенти со HNSCC. 14

Егзогениот MPS-1 протеин е присутен и во UMSCC-1 клетките и во условените медиуми. (а) МПС-1-трансфектирани (М) клетки го изразуваат протеинот во клеточните лизати. Вестерн блотовите беа испитани со моноклонално анти-His антитело кое го препознава неговиот означен протеин MPS-1 (~ 10 kDa). MPS-1 протеинот со His ознака беше откриен само во UMSCC-1/MPS-1 клетки (M) наместо во UMSCC-1/контролни ќелии (C). β-актин беше применет како контрола на вчитување на протеини. (б) MPS-1 се наоѓа не само во цитозолот туку и во јадрото. (в) Точкувањето со употреба на истото анти-His антитело покажа дека His-означениот MPS-1 е откриен во условениот медиум на UMSCC-1/MPS-1 клетките (M), но не и контролните клетки (C). [Фигурата во боја може да се види во онлајн изданието, кое е достапно на www.interscience.wiley.com.]

Зголемената експресија на MPS-1 го инхибира растот на клетките на туморот ин витро и in vivo

За да го тестираме ефектот на зголемената експресија на MPS-1 врз растот на клетките на HNSCC, извршивме ин витро анализа на растот на клетките. Како што е прикажано на сл. 2а, растот на UMSCC-1 клетки кои изразуваат високо ниво MPS-1 беше значително инхибиран во споредба со контролните клетки (стр < 0,01).

Високото ниво на MPS-1 протеин го инхибира растот на UMSCC-1 клетките ин витро и in vivo. (а) контролно-трансфектирани (♦) или MPS-1-трансфектирани (▪) клетки (1 × 10 4 клетки/mL) беа поплочени во плоча со 12 бунари и се бројат на 4 последователни дена (*стр < 0,01). барови, СД. (б) 2 × 10 6 клетки беа инјектирани субкутано во левото крило кај машки голи глувци, големината на туморот се мери секоја недела и се пресметуваше волуменот на туморот. (*стр < 0,01 за контрола против MPS-1). барови, СД. (в) репрезентативни тумори кај глувците беа прикажани при жртвување (стрела, тумор). (г) По жртвувањето, туморите се собирале и се мерат. Колони, значи тежина на туморот барови, СД. (*стр = 0,016. C: контрола M: MPS-1). [Фигурата во боја може да се види во онлајн изданието, кое е достапно на www.interscience.wiley.com.]

Покрај тоа, да се утврди дали високите нивоа на MPS-1 исто така го инхибираат растот на туморот in vivo, беа спроведени 2 експерименти со животни. Во 1 експеримент, 42 дена по инјектирањето на UMSCC-1/MPS-1 клетките во левото крило на голите глувци, ниту еден од глувците не формирал тумор на местото на инјектирање (0 од 6 глувци формирале тумор). Спротивно на тоа, сите глувци (6 глувци) кои примале инокулација на UMSCC-1/контролна клетка развиле тумори. Во повторувањето на истиот експеримент, сите глувци (6 глувци) инјектирани со UMSCC-1/MPS-1 клетки развија тумори, меѓутоа, почетокот на развојот на туморот беше одложен во споредба со UMSCC-1/контролните клетки (време на почеток: 28 дена за UMSCC-1/MPS-1 клетки наспроти. 14 дена за UMSCC-1/контролни ќелии). Следењето на волуменот на туморот покажа дека UMSCC-1/контролните клетки растеа побрзо од UMSCC-1/MPS-1 клетките in vivo (стр < 0,01) (сл. 2б). По жртвувањето на ден 47, просечната тежина на примарните тумори беше 0,17 g (n = 6) и 0,68 g (n = 4) за UMSCC-1/MPS-1 и UMSCC-1/Control тумори, соодветно (стр = 0,016) (сл. 2в и г). Колективно, овие податоци цврсто покажаа дека MPS-1 на високо ниво е силен инхибитор на HNSCC клетката што расте и двете ин витро и in vivo.

Зголемената експресија на MPS-1 ја нарушува стапката на пролиферација на туморските клетки

Откако утврдивме дека прекумерната експресија на MPS-1 може да го одложи почетокот на формирањето на туморот на HSNCC и да го забави растот на туморските клетки кај глувците, сакавме да утврдиме како неговото присуство го менува растот на туморот. Протеинот MPS-1 содржи 1 домен на цинк прст од C4 тип и цикличен аденозин монофосфат одговорен елемент затоа може да биде вклучен во поправка на ДНК и контрола на клеточниот циклус. 22, 23 За да го истражиме ефектот на прекумерна експресија на MPS-1 во контролата на клеточниот циклус во клетките HNSCC UMSCC-1, направивме анализа на ДНК клеточниот циклус со боење со пропидиум јодид и анализа на проток цитометрија на култивирани клетки. Покажа дека прекумерната експресија на MPS-1 предизвикува прекин на клеточниот циклус, како што е наведено од зголемениот број на клетки во фазата G0/G1 (UMSCC-1/контрола: 42,76% наспроти. UMSCC-1/MSP-1: 51,37%) додека намален број на клетки во S фаза (UMSCC-1/контрола: 28,42% наспроти. UMSCC-1/MPS-1: 19,12%). Сепак, анализата на клеточниот циклус не откри значајна разлика во однос на бројот на апоптотични клетки во фазата под G0 (сл. 3а). Ние дополнително ги обоивме туморските делови за Ki-67, кој е маркер за пролиферација присутен во текот на сите активни фази од клеточниот циклус (G1, С, Г2 и митоза), но отсутни во клетките во мирување (G0). Нашите податоци покажаа дека 18,73 ± 6,23% од UMSCC-1/контролните јадра на туморските клетки беа позитивно обоени за Ki-67, додека само 5,13 ± 2,94% од јадрата на туморските клетки UMSCC-1/MPS-1 беа Ki-67 позитивни (стр = 0,0003) (сл. 3б и в). Дополнително, ги проверивме апоптотичните туморски клетки со TUNEL боење на туморските делови и откривме дека многу малку клетки се TUNEL позитивни за UMSCC-1/контрола или за UMSCC-1/MPS-1 тумори (сл. 3г). Заедно, овие наоди укажуваат дека прекумерната експресија на протеинот MPS-1 во UMSCC-1 клетките резултира со запирање на растот на клетките наместо апоптоза и ја потиснува стапката на пролиферација на туморските клетки, што, барем делумно, придонесува за нарушениот раст на туморските клетки забележан и двете in vivo и ин витро.

Прекумерната експресија на MPS-1 ја намалува пролиферацијата на туморските клетки. (а) Анализата на ДНК клеточниот циклус беше изведена со боење со пропидиум јодид и проточна цитометрија. (б) Јадрата беа обоени кафеави (стрелки) со антитела на човечкиот Ki-67 (оригинално зголемување × 100). (в) Процент на јадра позитивно обоени со антитела Ки-67. Колони, просечен процент на Ki-67 позитивни јадра во 5 микроскопски полиња барови, СД. (*стр = 0,0003. C: контрола M: MPS-1). (г) анализа на апоптоза на ткивата на туморот со TUNEL боење (оригинално зголемување × 100). Малку клетки се позитивно обоени и кај контролните и кај MPS-1 туморите. Позитивната контролна слајд беше третирана со DNase I пред боење.

Инхибиран раст на туморот формиран од UMSCC-1/MPS-1 е поврзан со супресија на туморската ангиогенеза

Се покажа дека туморската ангиогенеза е главен фактор за раст на туморите 24 затоа решивме да испитаме дали инхибицијата на растот на туморите формирани од UMSCC-1/MPS-1 клетките е поврзана со изменетата туморска ангиогенеза. Ја утврдивме средната густина на микросадот со броење на туморските микросадови позитивно обоени со антитела CD34 во 5 области кои не се преклопуваат на секој туморски дел. Нашите податоци покажаа дека туморите формирани од UMSCC-1/MPS-1 клетки имаат помала средна густина на микросад (24,5 ± 6,7/поле) од оние формирани од UMSCC-1/контролни клетки (69,2 ± 16,4/поле) (стр = 0,0003) (сл. 4а и б). Овие резултати сугерираат дека потиснувањето на туморската ангиогенеза е уште еден фактор кој придонесува за нарушениот раст на туморските клетки на HNSCC кои изразуваат повеќе MPS-1 протеин.

Зголемениот MPS-1 е поврзан со намалена густина на микросад. (а) Туморскиот микросад беше обоен со антитела за CD34 на глувчето (стрелка, микросад). (б) Беше изброен бројот на садови. Колони, просечен број на садови во 5 микроскопски полиња (оригинално зголемување × 100) барови, СД. (*стр = 0,0003 за контролни тумори [C] наспроти. MPS-1 тумори [M]).

Зголемената експресија на MPS-1 ја намалува експресијата на паксилин

Бидејќи MPS-1 содржи домен на прст од цинк C4 тип и се наоѓа во јадрото, што сугерира дека MPS-1 може да биде протеин вклучен во регулацијата на изразување на други гени, извршивме анализа на генски микросреди и откривме дека нивото на mRNA на паксилин е намалено за 24-45% во UMSCC-1/ MPS-1 клеточна линија и 61-66% во UMSCC-1/MPS-1 тумори. За да се потврдат резултатите од генската низа на ниво на протеин, беше направено вестерн blotting и потврди дека протеинот паксилин, протеин на скеле за локална адхезија и пренос на сигналот, како и молекула поврзана со клеточниот раст и ангиогенезата (види подолу), е значително помал во и UMSCC-1/MPS-1 клеточна линија и тумори од нивните соодветни контроли (стр = 0,003) (сл. 5а, б и в). Имунохистохемиското боење на пресеците на туморот покажа дека протеинот паксилин главно се изразува во цитоплазмата. Во споредба со контролната група, помалку туморски клетки изразуваат протеин паксилин, а нивото на протеин беше исто така пониско во групата UMSCC-1/MPS-1 (сл. 5г). Овие наоди укажуваат дека MPS-1 ја намалува транскрипцијата на mRNA на паксилин, а со тоа и изразувањето на протеинот на паксилин во клетките на туморот.

Зголемениот MPS-1 ја потиснува експресијата на протеинот на паксилин. (а) Western blotting покажа дека експресијата на протеинот на паксилин е потисната во MPS-1 трансфектирана UMSCC-1 клеточна линија (M) во споредба со контролната клеточна линија (C). (б) Експресијата на протеинот на паксилин беше помала кај туморите формирани од UMSCC-1/MPS-1 клетките (C1, C2, C3: тумори од 3 контролни глувци M1, M2, M3: тумори од 3 глувци MPS-1). (в) Односот на интензитетот на протеинската лента на паксилин до β-актин со Western blotting беше пресметан со софтверот Image J. Колони, просечен сооднос барови, СД. (*стр = 0,003 за контролни тумори наспроти. MPS-1 тумори). (г) Протеинот Паксилин беше обоен со моноклонално античовечко антитело на паксилин од глувче. Протеинот беше изразен во помалку туморски клетки на пониско ниво во групата UMSCC-1/MPS-1 отколку во контролната група (на репрезентативните области беше прикажано оригинално зголемување × 100).


Антипролиферативни активности на други членови на семејството C/EBP

Иако C/EBPα е најинтензивно проучуван, неколку други членови на семејството исто така покажуваат антипролиферативна активност.

C/EBPβ

Присилното изразување на C/EBPβ во клетките на хепатокарциномот на HepG2 ги апси клетките на или во близина на границата G1-S (Бук и сор., 1994). Овој ефект бара и bZIP доменот и N-терминалната трансактивација секвенци, и не се репродуцира со транскрипционално инертната LIP изоформа. Покрај тоа, C/EBPβ-нокаут глувците покажуваат лимфопролиферативно нарушување, што сугерира дека C/EBPβ го инхибира проширувањето на одделот на лимфоидните клетки (Screpanti et al., 1995). Неколку опсервации, исто така, укажуваат на антипролиферативна функција на C/EBPβ во епидермалните кератиноцити: (1) изразувањето на C/EBPβ во кератиноцитите BALB/MK2 го инхибира формирањето на колонии (2) глувците на кои им недостасува C/EBPβ покажуваат блага епидермална хиперплазија и (3) добиени од кератиноцити. C/EBPβ мутантните глувци покажуваат делумно дефектен Ca2+-индуциран застој на растот ин витро (Zhu et al., 1999). Изразувањето на диференцијалните маркери кератин 1 (К1) и К10 е исто така намалено во овие клетки, што укажува дека C/EBPβ го регулира прекинот на пролиферацијата, како и гени специфични за диференцијацијата. Така, C/EBPβ придонесува за запирање на растот и диференцијација на кератиноцитите, што е слично на двојните функции на C/EBPα во терминално диференцирачките клетки.

Ектопична експресија на C/EBPβ во примарните фибробласти индуцира излез од клеточниот циклус преку механизам кој бара активност на RB-E2F (Т. Себастијан, С. Томас, Ј. Сејџ и П.Ф.Ј., необјавени). Фибробластите затворени со C/EBPβ покажуваат морфолошки карактеристики кои се индикативни за остарените клетки. Слична старечка состојба е исто така предизвикана од прекумерна експресија на Ras V12 и други онкогени во примарните, неовековечени клетки (Lin and Lowe, 2001 Serrano et al., 1997). Примарните клетки кои изразуваат Ras V12 влегуваат во неповратно прекинување на G1 кое бара индукција на патеките за супресор на туморот p16 INK4a -RB и p19 ARF -p53. This oncogene-induced, `premature' senescence is thought, like apoptosis, to provide a barrier to neoplastic transformation and cancer. Interestingly, Ras V12 -expressing C/EBPβ –/– MEFs fail to senesce and instead continue to proliferate, although (in contrast to p19 ARF - or p53-deficient cells) they are not fully transformed (T. Sebastian, S. Thomas, J. Sage and P.F.J., unpublished). C/EBPβ seems to function in concert with RB-E2F to arrest cells at the G1-S boundary, probably by repressing S-phase genes. Thus, C/EBPβ is an important regulator of cell-cycle exit/senescence induced by Ras V12 in primary cells. Post-translational activation of C/EBPβ by Ras-stimulated kinases (Hanlon and Sealy, 1999 Mo et al., 2004 Nakajima et al., 1993 Shuman et al., 2004) may be one pathway by which oncogenic Ras V12 signaling is linked to premature senescence.

Growth arrest induced by C/EBPβ is highly context specific, because in several cases C/EBPβ displays growth-promoting activity. For example, mammary epithelial cells (MECs) from C/EBPβ –/– female mice have a proliferation defect that leads to impaired ductal morphogenesis and a failure to lactate (Robinson et al., 1998 Seagroves et al., 1998). Conversely, ectopic C/EBPβ expression in a human MEC cell line (MCF10A) induces hyper-proliferation and the cells acquire a partially transformed phenotype (Bundy and Sealy, 2003). A growth-stimulatory effect of C/EBPβ is also observed in macrophage tumor cells (Wessells et al., 2004). Interestingly, deletion of the CEBPB gene renders mice totally resistant to carcinogen-induced skin tumor development (Zhu et al., 2002), and low levels of C/EBPβ expression enhance, rather than inhibit, Ras V12 -induced focus formation in NIH 3T3 cells (Shuman et al., 2004 Zhu et al., 2002). A data-mining approach has also associated C/EBPβ expression with cyclin-D1-dependent tumors (Lamb et al., 2003). Hence, C/EBPβ can function as a pro-oncogenic transcription factor that promotes proliferation and/or survival of some tumor cells. How it stimulates mitotic growth and why it elicits completely opposite effects on proliferation in different cellular contexts are intriguing questions for future investigation.

C/EBPδ

DeWille and coworkers have described a role for C/EBPδ in G0 arrest of MECs. Proliferating HC11 or COMMA D mammary cells express low levels of C/EBPδ, but when they undergo G0 arrest in response to serum withdrawal, C/EBPδ mRNA and protein levels increase significantly (O'Rourke et al., 1997 O'Rourke et al., 1999). The effect is specific to G0 MECs, since C/EBPδ levels do not increase in other cells, nor is induction observed when MECs arrest at other stages of the cell cycle. Expression of C/EBPδ antisense RNA inhibits endogenous C/EBPδ expression and prevents the cells from entering G0 upon serum withdrawal. Further experiments have implicated the transcription factor STAT3 in activating CEBPD gene transcription in response to low levels of serum (Hutt et al., 2000). A cytokine or related factor, acting in an autocrine manner, might therefore control CEBPD induction by activating Jak/STAT3 signaling. Indeed, oncostatin M induces growth arrest in MECs by a C/EBPδ-dependent mechanism (Hutt and DeWille, 2002).

C/EBPδ also regulates proliferation of MECs in vivo. C/EBPδ is induced during mouse mammary gland involution, which is the period following the end of lactation when extensive tissue remodeling and regression occur (Gigliotti and DeWille, 1998). Female C/EBPδ-knockout mice reproduce and lactate normally (Sterneck et al., 1998) however, nulliparous mutant animals display increased mammary ductal growth and branching, and show a higher epithelial bromodeoxyuridine (BrdU) labeling index than wild-type controls (Gigliotti et al., 2003). Involution and associated cellular apoptosis was not affected, although other work shows that these responses are delayed in C/EBPδ –/– animals (E. Sterneck, personal communication). The different results might reflect the fact that C/EBPδ –/– mice of different strain backgrounds were used in the two studies. The involvement of C/EBPδ in control of MEC proliferation raises the possibility that C/EBPδ functions as a tumor suppressor. It will therefore be interesting to determine whether tumor-associated C/EBPδ mutations exist and contribute to the transformed phenotype of cancer cells.

C/EBPϵ

C/EBPϵ is expressed exclusively in hematopoietic cells and their progenitors. C/EBPϵ-null mice are viable but lack functional neutrophils and eosinophils, and eventually develop myelodysplasia (Verbeek et al., 2001 Yamanaka et al., 1997). Conversely, forced expression of C/EBPϵ induces differentiation of promyelocytic leukemia cells (Lekstrom-Himes, 2001 Truong et al., 2003). These findings indicate a role for C/EBPϵ in differentiation and proliferation arrest of myeloid progenitors. The antiproliferative activity of C/EBPϵ might involve E2F-RB, since interactions with E2F1 and pRB have been observed and C/EBPϵ can repress transcription of E2F targets such as Myc (Gery et al., 2004). C/EBPϵ thus mimics many of the functions of C/EBPα and may provide a second pathway by which terminal granulocytic differentiation is implemented (Zhang et al., 2002).


Quiescence stem cells are at the heart of mutation susceptibility and life expectancy

Protecting the stem cell compartment from DNA damage is not an easy task for a long-lived animal and requires considerable effort. How difficult this task is may be illuminated when considering the endogenous somatic mutation rate in human cells in vivo. Adult human cells, e.g., skin fibroblasts have accumulated hundreds of mutations even in sun-protected areas most likely due to replication errors 44,45 suggesting that aging humans gradually harbor mutations in cancer-driver genes and that exogenous factors such as ultraviolet (UV) light further predisposes the rate of mutation to a level that frequently results in cancer. In sun-exposed human epidermis, the burden of somatic mutations averaged two to six mutations per megabase per cell. 46 From studies with human organoid cultures derived from stem cells from donors of ages varying from 3 to 87 years-old, it has been shown that the mutational load increases steadily over time at a rate of approximately 40 novel mutations every year. 47 Although it is unclear whether this rate of mutations is sufficient to drive cancer development in different tissues, it highlights the existence of mechanisms that protect stem cell populations and delay the accumulation of cancer-driver mutations until reaching the end of the reproductive age. Reduction of mutation rates can be achieved by attenuating endogenous and exogenous deleterious effects on DNA integrity. The observation that human somatic cells “accumulate mutations 4 to 25 times more rapidly than germline cells do” 48 suggests the existence of potential areas of intervention by which the mutation burden load could be further reduced. Establishment of a “deep quiescence” state 49 in the stem cell population, along with enhanced detoxification and more efficient DNA repair may keep the mutational load low enough to prevent cancer beyond the reproductive age and enhance the natural life expectancy.

A relationship between life expectancy and mutation rate has been suggested by Failla in the 1950s, when he stated that “the important point is that the average spontaneous mutation rate of a somatic cell of a short-lived species be higher than that of the somatic cells of a long-lived species and approximately in the inverse ratio of the life spans”. 50 Whether Failla has been right is still unclear but a recent study by Blokzijl et al. 47 summarized some of their findings by saying that “although variation in tissue-specific mutation spectra in mice has been reported previously, we observed a difference in both mutation rate and spectrum in human cells. This indicates that mutation data derived from mice are not necessarily suitable for interpreting mutational processes and their consequences in humans.” 47 Similarly, Vijg et al. 51 suggest that mutation rate per base and replication in mouse germ cells and somatic cells is significantly higher than in humans. In their Fig. 6, they state: “The somatic mutation rate was nearly two orders of magnitude higher than the germline mutation rate in both species in mice, both the germline and somatic mutation rates were several times higher than their human equivalents.” This may explain why in some studies the cancer rate in mice is considerably higher than in humans. 8

One of the studies on somatic mutational load in human fibroblasts suggested that the majority of these mutations occur during development when the proliferation rate is high, whereas few are added in adult life when proliferation in fibroblasts is low. 45 This supports the notion that replication is a “dangerous” process associated with errors that can accumulate astonishing numbers of mutations over time and form the platform on which cancer cells may build upon. E.g., human cells of self-renewing tissues such as colon and intestine add about 40 mutations every year. 47

There is growing evidence that understanding human adult stem cell biology and the factors regulating stem cell proliferation and quiescence will help to improve our ideas about the carcinogenic process as well as conditions associated with aging and tissue degeneration. The complexities of stem cell biology and human stem cell terminology and nomenclature are still confusing. 52 Although quiescent stem cells in the mouse can rescue tissues after catastrophic irradiation, the question remains whether this response to massive cell death is the true purpose of such quiescent stem cells. It is interesting to note that these putative reserve stem cells, activated by catastrophic events, are often found in the digestive tract (intestine crypts, basal cell layer of oral, esophageal and anal squamous epithelia). Quiescence of these cells may also guarantee that even if cytotoxic reagents taken up with food, these toxins will not destroy the entire stem cell compartment but just the “lower” quality active stem cell compartment. Recently, a similar idea has been tested in intestinal crypts. 53 Kaiko et al. 53 claim that metabolites from the microbiome can have inhibitory effects on crypt stem cells but the structural organization of the crypt prevents that such metabolites reach critical concentration at the base of the crypt and therefore will generally not affect the stem cells. The principal idea is that the stem cell compartment may require a protective shield and a back-up system that prevents toxic products passing through or generated within the digestive system from causing irreversible damage. The ability to overcome this threat by having a relatively inert reserve stem cell population that can repair the tissue once the active stem cell population is exhausted, could be advantageous. The catastrophic events that are brought upon experimental mice or human patients undergoing radio- and chemotherapy may only represent extreme situations, in which the reserve stem cell compartment becomes evident. In general, these reserve stem cells may work undetected and may have evolved to confront the acute problem of toxic substances impairing tissue and stem cell function.

Another question is whether quiescent stem cells are actually required for a short-lived animal like the mouse. As Clevers pointed out “it appears somewhat counterintuitive that cells whose only raison d'être is the generation of daughter cells, would rarely divide”. 52 From an evolutionary point of view, does a mouse need quiescent stem cells to achieve the major function quiescent stem cells supposedly have: to maintain a tissue over prolonged time with minimal stem cell divisions to avoid tumorigenesis and repair the tissue once the active stem cells have been eliminated? Even if this hypothesis is true for humans, little evidence substantiates the idea that relative quiescence reduces tumorigenesis in an animal with a lifespan of several decades. Many unanswered questions await a new generation of comparative and evolutionary stem cell biologists. However, if quiescence reduces mutation rates and thereby enhances organismal survival then accumulation of mutations and mutation in genes regulating DNA repair should at least be associated with aging and tumorigenesis (somatic mutation theory combined with a stem cell theory of aging). Indeed, basically all known premature aging syndromes have a connection to DNA repair or nuclear architecture. Furthermore, mutations accumulate with age, DNA repair systems deteriorate with age and many models of impaired DNA repair result in reduced lifespan (summarized in ref. 54 ). Both these theories of aging (mutational and stem cell) can be closely related especially if adult tissue stem cells can become cancer-initiating cells and accumulation of mutations in stem cells leads to senescence or impaired stem cell function. There is some evidence that defects in stem cell DNA repair contribute to aging. 55,56,57,58 Whether short-lived mammals have lower quality DNA repair systems than long-lived mammals is unclear and may not be necessary when focusing on stem cells and their protection by quiescence rather than by higher DNA repair rates. 59 Again, our descriptive findings in human oral mucosa indicate that the quiescent basal cell layer expresses elevated levels of several key repair genes (e.g., XPC and associated factors). 21 It is interesting that several experiments on stem cell populations and especially quiescence have identified an innate immune system association. 32,60 Oki et al. 32 report that the top six gene ontology (GO) terms associated with quiescent fibroblasts are all related to inflammation, immune defense and wound response. Protecting the quiescence stem cells on every level that may alter its genetic integrity (DNA mutations and integration of viral genomes, e.g., HPV) seems to be the priority of the quiescent state. Therefore, gene signatures relevant for DNA repair and innate immunity may be characteristic for quiescent stem cells.


Targeting cleavage and polyadenylation specific factor 1 via shRNA inhibits cell proliferation in human ovarian cancer

Cleavage and polyadenylation specificity factor 1 (CPSF1), a member of CPSF complex, has been reported to play a key role in pre-mRNA 3′-end formation, but its possible role in ovarian cancer remains unclear. In the present study, we found the mRNA level of CPSF1 was overexpressed in ovarian cancer tissues using Oncomine Cancer Microarray database. Then the loss-of-function assays, including CCK-8, colony formation and flow cytometry assays, were performed to determine the effects of CPSF1 on cell viability, proliferation, cell cycle and apoptosis of human ovarian cancer cell lines (SKOV-3 and OVCAR-3). The results indicated that depletion of CPSF1 suppressed cell viability, impaired colony formation ability, induced cell cycle arrest at G0/G1 phase and promoted cell apoptosis in ovarian cancer cells. Furthermore, knockdown of CPSF1 upregulated the expression of cleaved caspase-3 and PARP and downregulated CDK4/cyclin D1 expression. These data suggested that CPSF1 could promote ovarian cancer cell growth and proliferation ин витро and its depletion might serve as a potential therapeutic target for human ovarian cancer.

Ова е преглед на содржината на претплата, пристап преку вашата институција.


Погледнете го видеото: Митоз, деление Клетки. Просто о сложном (Август 2022).