Информации

VDJ секвенционирање кај глувци, ДНК или РНК?

VDJ секвенционирање кај глувци, ДНК или РНК?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Се прашувам дали некој кој е добро упатен во VDJ секвенционирањето за TCR анализа на репертоарот (конкретно CDR3) би знаел дали ДНК или РНК се подобар почетен материјал? Ги разгледуваме ефектите на терапијата со зрачење врз имунолошкиот систем на глувците. Благодарам


Замена на генот на тежок синџир на имуноглобулин: Механизам на уредување на рецепторите

Генериравме трансгенски (sd-tg) модел на глушец насочен кон локацијата во кој ЈХ локусот е заменет со преуреден VDJ кој кодира за тешкиот ланец на анти-ДНК антитело. Кај овие глувци, Б-клетките кои ја изразуваат специфичноста на анти-dsDNA се негативно регулирани. Набљудуваме нов механизам за толеранција на Б-клетките, уредување на рецепторите на локусот на тешкиот ланец. Во повеќето sd-tg Б-клетки, вметнатата анти-ДНК VХ генот е заменет со горе ендогениот ВХ, или ДХ, или двата гени преку рекомбинација со хептамерот вграден на 3' крајот на повеќето VХ гени. Идентификувани се три типа на настани на рекомбинација: ВХ-на-ВДЈ, ДХ-на-ВДЈ, и ВХ-до-ДХ-ВДЈ. Анализата на спојните секвенци откри карактеристики на класичното V(D)J преуредување, имено додавање на N секвенца и бришење на нуклеотиди. Конзервиран нонамер беше пронајден 12 од спротиводно од вградениот хептамер. Овој неамер може да претставува нова сигнална секвенца за рекомбинација што се користи за VХ уредување. Така, моделот sd-tg обезбедува директен доказ за секундарно преуредување на ВХ-Д-ЏХ. Овој процес може да игра улога во толеранцијата со уредување на автореактивни рецептори и исто така може да послужи за разновидност на VХ репертоар.


„Да се ​​види овој драматичен одговор во нашиот модел на глушец прогерија е еден од највозбудливите терапевтски случувања во кои сум бил дел во последните 40 години како лекар-научник“.

- Френсис Колинс, директор на Националниот институт за здравство и виш истражувач во Националниот институт за истражување на човечкиот геном

На групи глувци им била дадена единечна инјекција три дена или 14 дена по раѓањето со адено-асоцирани вируси кои го кодираат основниот уредник. На возраст од шест недели, генската корекција беше пронајдена во повеќе органи на нивоа кои се движат од околу 10 до 60 проценти.

До шест месеци, клучните органи, вклучително и срцето на животните на кои им беше вбризгано основен уредувач, содржеа многу пониски нивоа на прогерин од контролните глувци со прогерија инјектирани со солен раствор. Дополнително, додека аортата на контролните глувци покажа голема загуба на васкуларните мазни мускулни клетки и високи нивоа на адвентицијална фиброза - акумулација на фиброзни клетки околу аортата - аортата на глувците инјектирана со основниот уредник изгледаше слична на примероците од здрави глувци.

„Го видовме ова неочекувано, речиси целосно, спасување на патологијата во аортата“, рече Лиу. „Направивме голем број дополнителни експерименти за да се увериме дека не сме заведени. Примероците од аортата речиси не се разликуваа од нормалните примероци на глувци, што беше зачудувачки. Клетките од базно уредуваните глувци го правеа коригираниот човечки протеин ламин А наместо прогерин.

Инјекцијата за уредување на базата, исто така, значително го продолжи животниот век на третираните глувци и ја подобри нивната виталност. Здравиот глушец живее околу две години. Третираните глувци преживеале просечно 510 дена, што одговара на почетокот на староста - и е повеќе од двојно повеќе од времето што го живееле нетретираните глувци.

Драматичното продолжување на животниот век кај третираните глувци „беше навистина длабок резултат“, рече Браун, „бидејќи децата со прогерија рано умираат од васкуларна болест. Тие страдаат од срцеви и мозочни удари“.

„Кога мојата истражувачка лабораторија ја идентификуваше генетската причина за прогерија во 2003 година, се надевавме дека еден ден тоа може да доведе до начин да им помогнеме на овие деца“, рече Колинс. „Попатно, постигнавме одреден напредок со терапијата со лекови, но потенцијалот всушност да се поправи основната причина на ниво на ДНК е над сè што можевме да замислиме тогаш. Да се ​​види овој драматичен одговор во нашиот модел на глушец прогерија е еден од највозбудливите терапевтски случувања во кои сум бил дел во последните 40 години како лекар-научник“.

„Како лекар-научник, неверојатно е возбудливо да се мисли дека идејата на која сте работеле во лабораторија може всушност да има терапевтско влијание“, рече Браун. „На крајот на краиштата, нашата цел ќе биде да се обидеме да го развиеме овој пристап за луѓето, иако има преостанати прашања што треба прво да ги решиме во овие модели системи“.

Иако тимот не забележал значајни нецелни измени од основниот уредник, голем број од најдолговечните третирани глувци развиле тумори на црниот дроб - позната долгорочна компликација кога се користат адено-асоцирани вируси за доставување гени на глувци.

Во тек се дополнителни студии за безбедност и ефикасност за дополнително да се испитаат овие резултати и да се истражат потенцијалните начини за ублажување на ризиците. Резултатите од работата се пренесуваат во понатамошни претклинички студии, со евентуална цел да се започне клиничко испитување.

„Оваа работа дава и план за потенцијален третман на други генетски болести кои можат да се решат со базично уредување“, вели Лиу. „Тоа ја засилува не само нашата возбуда, туку и нашето чувство за одговорност да продолжиме да се занимаваме со внимателна наука додека на пациентите им нудиме најдобра можна шанса да имаат корист“.

Ова истражување беше помогнато во дел од Фондацијата за истражување на Progeria, Националниот институт за здравство (U01AI142756, UG3AI150551, UG3TR002636, RM1HG009490, R01EB022376, R35GM118062, Z01HG200305, R01HL146654, R01HL126784), интрамурален поддршка од проектот ZIA HG 200-305-18, и Медицинскиот институт Хауард Хјуз.

Наведен труд: Koblan LW, Erdos MR, et al. Ин виво Уредувањето на базата на аденин го спасува синдромот на прогерија Хачинсон-Гилфорд. Природата. Онлајн 6 јануари 2021 година. DOI: 10.1038/s41586-020-03086-7


VDJ секвенционирање кај глувци, ДНК или РНК? - Биологија

Презентацијата и препознавањето на антигенот е централно за имунологијата. HLA гените ги кодираат протеините кои ги претставуваат антигените. VDJ гените ги кодираат рецепторите: Т-клеточни рецептори (TCR) во Т-клетките и репертоарите на антитела/имуноглобулини во Б-клетките.

Овде, истражувачите можат да најдат врски до алатки и ресурси за пресметковна анализа на HLA и VDJ податоци.

Нема скршени врски на оваа страница ако оваа значка е зелена:

Содржина

Robson, K. J., Ooi, J. D., Holdsworth, S. R., Rossjohn, J. & Kitching, A. R. HLA и бубрежна болест: од асоцијации до механизми. Нат. свештеникот Нефрол. 14, 636-655 (2018)

La Gruta, N. L., Gras, S., Daley, S. R., Thomas, P. G. & Rossjohn, J. Разбирање на двигателите на MHC ограничувањето на Т-клеточните рецептори. Нат. Rev. Immunol. 18, 467-478 (2018)

Заедница на репертоар на адаптивни имунолошки рецептори (AIRR).

Заедницата на репертоарот за адаптивни имунолошки рецептори (AIRR) на Друштвото за антитела е група водена од истражување која ги организира и координира засегнатите страни во употребата на технологиите за секвенционирање на следната генерација за проучување на репертоарите на антитела/Б-клетки и Т-клеточни рецептори. Неодамнешниот напредок во технологијата на секвенционирање овозможи да се проба од имунолошкиот репертоар со исклучителни детали. AIRR секвенционирањето (AIRR-seq) има огромно ветување за разбирање на динамиката на имунолошкиот репертоар во вакцинологијата, заразните болести, автоимунитетот и биологијата на ракот, но исто така поставува значителни предизвици. Заедницата AIRR беше формирана за да одговори на овие предизвици.

Јавна база на податоци за меморија и секвенци на наивни Б-клеточни рецептори

Претставуваме јавна база на податоци со повеќе од 37 милиони уникатни BCR секвенци од тројца здрави возрасни донатори, која е многу пати подлабока од кој било постоечки ресурс, заедно со збир на онлајн алатки дизајнирани да ја олеснат визуелизацијата и анализата на анотираните податоци.

Секвенци и структури на засилувачи на антитела врзувачки за коронавирус

Оксфордската протеинска информатичка група (Оддел за статистика, Универзитетот во Оксфорд) соработува во напорите да се разбере имунолошкиот одговор на инфекцијата и вакцинацијата со САРС-КоВ2. Како дел од нашите истраги, ја објавуваме и одржуваме оваа јавна база на податоци за да ги документираме сите објавени/патентирани врзувачки антитела и нанотела за коронавируси, вклучувајќи ги SARS-CoV2, SARS-CoV1 и MERS-CoV.

Проект за хумани вакцини (Програма за човечки имунитет)

Програмата за човечки имунитет (HIP) е напор со отворен код со цел да се секвенционираат сите адаптивни рецептори на површината на човечките Б и Т-клетки. Под целни напори од 7 до 10 години, програмата ќе ги секвенционира овие рецептори од група глобално различни поединци и ќе ја одреди структурата и функцијата на клучната подгрупа на рецептори. Преку пристап со отворен код, овие податоци ќе им бидат достапни на истражувачите ширум светот.

Нурнете во најголемата колекција на TCR и BCR секвенци во светот. Лесно вклучете милиони секвенци на јавни податоци во вашите следни трудови и проекти користејќи immunoSEQ Analyzer. Конструирајте свои проекти, извлечете свои заклучоци и слободно објавувајте нови откритија.

Погледнете ги овие упатства за совети како да преземате податоци од immuneACCESS.

iReceptor го олеснува курирањето, анализата и споделувањето на репертоарите на рецепторите на антитела/Б-клетки и Т-клетки (Adaptive Immune Receptor Repertoire или AIRR-seq податоци) од повеќе лаборатории и институции. Посветени сме да обезбедиме платформа за истражувачите да ја зголемат вредноста на нивните податоци преку споделување со заедницата. Ова во голема мера ќе го зголеми количеството достапни податоци за одговор на сложени прашања за адаптивниот имунолошки одговор, забрзувајќи го развојот на вакцините, терапевтските антитела против автоимуни болести и имунотерапиите за рак.

McPAS-TCR: Рачно куриран каталог на секвенци на Т-клеточни рецептори поврзани со патологија

McPAS-TCR е рачно куриран каталог на секвенци на Т-клеточните рецептори (TCR) кои беа пронајдени во Т-клетките поврзани со различни патолошки состојби кај луѓето и кај глувците. Наменет е да ги поврзе TCR секвенците со нивната цел на антигенот или со патологијата и органот со кој се поврзани.

PIRD: Пан имунолошки репертоар база на податоци

Базата на податоци на пан имунолошкиот репертоар (PIRD) собира сурови и обработени секвенци на имуноглобулини (IGs) и Т-клеточни рецептори (TCRs) на човечки и други видови 'рбетници со различни фенотипови. Можете да ги проверите деталните информации за секој примерок во базата на податоци, да изберете примероци за анализа според вашата потреба и да испраќате податоци за анализа. Резултатите од вашата анализа ќе бидат автоматски зачувани, па можете да се вратите за да ги проверите во секое време. PIRD е развиен од лабораторијата за имунолошки и здравје на BGI-истражувањето.

Џанг, В. и сор. PIRD: Пан имун репертоар база на податоци. Биоинформатика 36, 897–903 (2020)

STCRDab: База на податоци за структурни Т-клеточни рецептори

Автоматизиран, куриран сет на структурни податоци на T-Cell Receptor од PDB.

TCR3d: база на податоци за структурниот репертоар на рецепторот на Т-клетките

Добредојдовте во базата на податоци за структурниот репертоар на Т-клеточните рецептори (TCR). Овде обезбедуваме интерфејс кој е лесен за употреба за да ги видите сите експериментално одредени структури на рецепторот на Т-клетките и нивните комплекси. Ова вклучува јамки за одредување на комплементарноста на регионот и анализа на интерфејси со антигенски пептид и MHC.

Ние, исто така, собравме збир на познати TCR секвенци од неодамнешните студии, вклучително и напорите за секвенционирање на репертоарот на TCR.

Главната цел на оваа страница е да овозможи увид во основата на структурата и препознавањето на TCR, да помогне во напорите за предвидливо моделирање на оваа клучна компонента на адаптивниот имунолошки одговор и да го олесни рационалното инженерство на подобрени и нови имунотерапевти.

VDJDB: Курирана база на податоци за секвенци на Т-клеточни рецептори со позната специфичност на антигенот

Примарната цел на VDJdb е да го олесни пристапот до постоечките информации за специфичностите на антигенот на Т-клеточниот рецептор, т.е. способноста да се препознаат одредени епитопи во одредени MHC контексти.

Нашата мисија е да ги собереме скудните информации за специфичноста на TCR достапни досега и да создадеме курирано складиште за складирање на такви податоци.

ALICE: Антиген-специфична идентификација на лимфоцити со групирање на проширени секвенци

Откривање на TCR вклучен во имунолошки одговори од единечни сетови на податоци RepSeq.

КОНГА: Анализа на графикот на клонотип на соседот

Пајтон скрипти и C++ код

CONGA беше развиен за да открие корелација помеѓу профилот на изразување на генот на Т-клетката и секвенцата на TCR во збирките на податоци со една клетка.

ClusTCR: интерфејс на Python за брзо групирање на големи групи на CDR3 секвенци со непозната специфичност на антигенот

Модулот за кластерирање CDR3 обезбедува нов метод за брзо и прецизно групирање на големи збирови на податоци од секвенци на аминокиселини CDR3 и нуди функционалности за низводно анализа на резултатите од кластерирањето.

Пристап за кластерирање во два чекора што ја комбинира брзината на библиотеката за кластерирање Faiss со точноста на Марков алгоритам за кластерирање На стандардна машина*, clusTCR може да групира 1 милион CDR3 секвенци за помалку од 5 минути.

DeepTCR: Методи за длабоко учење за парсирање на секвенционирање на Т-клеточни рецептори (TCRSeq)

DeepTCR е python пакет кој има колекција на методи за длабоко учење без надзор и надгледување за анализирање на податоците од TCRSeq. Ја има дополнителната функционалност да може да ги анализира влезовите на спарените алфа/бета синџири, како и да може да ја земе употребата на генот v/d/j и контекстуалните информации за HLA во кои биле видени TCR-секвенците (т.е. HLA алели за репертоар од даден човечки примерок).

dkm: Динамичко совпаѓање на јадрото

DKM е аналоген на конволуциона мрежа, но за секвенци. Размислете за проблемот со класифицирање на низа. Бидејќи некои секвенци се подолги од другите, бројот на карактеристики е неправилен. Со оглед на специфичната низа, предизвикот е да се одреди соодветната пермутација на карактеристиките со тежини, што ни овозможува да ги извршиме карактеристиките низ статистичкиот класификатор за да генерираме предвидување. За да ја пронајдеме пермутацијата на карактеристиките што покажуваат максимален одговор, како на пример како max-pooling ја идентификува закрпата на сликата што покажува максимален одговор, користиме алгоритам за порамнување на секвенци.

enclone е самостоен софтвер (првенствено напишан во Rust) развиен од 10x Genomics за анализа на едноклеточни TCR и BCR секвенци. enclone врши клонотипирање со свесност за SHM, филогенетска/лиза анализа, порамнување на повеќе секвенци и обезбедува исклучително брз интерфејс за анализа, прикажување и извоз на VDJ, генска експресија и баркодирање на карактеристики (REAP-seq, CITE-seq, ECCITE-seq, ВАГА-сек, PERTURB-сек, итн.) податоци.

immunarch: R пакет за безболна биоинформатичка анализа на податоци од имунолошкиот репертоар на Т-клетките и Б-клеточните

immunarch е R пакет дизајниран да ги анализира репертоарите на Т-клеточните рецептори (TCR) и B-клеточните рецептори (BCR), наменети за медицинските научници и биоинформатичарите. Мисијата на имунарх е да ја направи анализата на податоците за имунолошка секвенца што е можно поедноставна и да ви помогне да се фокусирате на истражување наместо на кодирање. Следете не на Твитер за новости и ажурирања.

immuneSIM: Прилагодлива симулација на репертоари на Б- и Т-клеточни рецептори

Симулирајте целосни репертоари на рецептори на Б-клетки и Т-клетки користејќи процес на рекомбинација во силико, кој вклучува широк спектар на прилагодливи параметри за воведување шум и пристрасност. Дополнителните функции за модификација по симулацијата му овозможуваат на корисникот да имплантира мотиви или пристрасност на кодони, како и да ја ремоделира архитектурата на сличност на секвенците. Излезните репертоари содржат записи за сите релевантни димензии на репертоарот и може да се анализираат со помош на дадените функции за анализа на репертоарот. Preprint е достапно на bioRxiv (Weber et al., 2019 doi: 10.1101/759795).

ImReP: Брзо и точно профилирање на адаптивните имунолошки репертоари од редовни податоци RNA-Seq

ImReP е метод за квантифицирање на индивидуалниот имунолошки одговор врз основа на рекомбинација на гените што ги кодираат рецепторите на Б и Т-клетките (BCR и TCR). ImReP е во состојба ефикасно да извлекува TCR и BCR читања од податоците на RNA-Seq и да собира клонотипови (дефинирани како клонови со идентични CDR3 амино киселински секвенци) и да детектира соодветни V(D)J рекомбинации. Користејќи ја техниката на кластерирање CAST, ImReP може да ги коригира собраните клонотипови за PCR и грешки во секвенционирањето.

IMSEQ: Анализа на имуногенетска секвенца

IMSEQ е брза алатка која знае за грешки при PCR и секвенционирање за анализирање на податоци со висока пропусност од експерименти за секвенционирање на рекомбинирани Т-клеточни рецептори или имуноглоболински гени. Извлекува имунолошки репертоари од секвенционирање на податоци во формат FASTA / FASTQ.

MiGMAP: мапер за секвенционирање на репертоар на Т- и Б-клетки со целосна должина

Накратко, овој софтвер е паметна обвивка за алатката за мапирање IgBlast V-(D)-J дизајнирана да ја олесни анализата на библиотеките на имунолошките рецептори, профилирани со секвенционирање со висок пропуст. Овој пакет вклучува дополнителни експериментални модули за контигно склопување, корекција на грешки и конструкција на лоза на имуноглобулин.

MiXCR: универзална алатка за брза и точна анализа на податоците за секвенционирање на репертоарот на Т- и Б-клеточните рецептори

MiXCR е универзална рамка која обработува големи имунолошки податоци од необработени секвенци до квантитирани клонотипови. MiXCR ефикасно се справува со спарени и единечни читања, го зема предвид квалитетот на секвенцата, ги коригира PCR грешките и ги идентификува хипермутациите на герминативните линии. Софтверот поддржува и делумно и целосно профилирање и ги користи сите достапни информации за РНК или ДНК, вклучувајќи секвенци горе од V и низводно од сегментите на генот J.

Пајтонски скрипти и Jupyter тетратки

Варијационален автоенкодер со повеќе прегледи (mvTCR) за заеднички да ги вградува информациите за транскриптомската и TCR секвенцата на ниво на една клетка за подобро доловување на фенотипското однесување на Т-клетките.

PRESTO: Комплет со алатки за секвенционирање на репертоар

PRESTO е комплет со алатки за обработка на необработени отчитувања од секвенционирање со висок процент на репертоари на Б-клетки и Т-клетки.

Комплетот со алатки за секвенционирање на репертоар (pRESTO) е составен од пакет на алатки за справување со сите фази на обработка на секвенците пред доделувањето на сегментот на герминативните линии. PRESTO е дизајниран да се справува со единечни или спарени читања. Вклучува функции за контрола на квалитетот, маскирање на прајмер, прибелешка на читања со вградени баркодови во низа, генерирање на консензус секвенци за уникатни молекуларни идентификатори (UMI), склопување на читања со спарени краеви и идентификација на дупликат секвенци. Вклучени се и бројни опции за сортирање на секвенци, земање примероци и операции за конверзија.

pyIR: Обвивка и парсер на IgBLAST

PyIR е минимално зависна обвивка со голема брзина за IgBLAST имуноглобулинскиот и Т-клеточниот анализатор. Ова се постигнува преку раздвојување на збирот на влезни податоци и паралелно вклучување на IgBLAST еднојадрено за подобро искористување на модерните процесори со повеќе јадра и хипернишки.

Recon: Реконструкција на проценетите заедници од набљудуваните броеви

Recon ја користи дистрибуцијата на бројот на видови во примерок за да ја процени дистрибуцијата на бројот на видови во популацијата од која е извлечен примерокот.

scirpy: Scanpy екстензија за анализа на TCR податоци од една ќелија.

Scirpy е скалабилен пакет со алатки за питон за анализа на репертоари на Т-клеточните рецептори (TCR) од податоците за секвенционирање на РНК на една клетка (scRNA-seq). Беспрекорно се интегрира со популарната библиотека за скенирање и обезбедува различни модули за увоз, анализа и визуелизација на податоци.

scRepertoire: Алатник за едноклеточно имуно профилирање

scRepertoire v1.0.0 ја додаде функционалноста на пристапот powerTCR за споредување на дистрибуцијата на големината на клоновите, ве молиме наведете го ракописот ако ја користите функцијата clonesizeDistribution(). Слично на тоа, примената на нови индекси за динамика на клонотип на една клетка во функцијата StartracDiversity() се заснова на работата од Lei Zhang и сор.

Софтверски алатки за анализа на репертоари на рецептори за Т-клетки специфични за епитоп (TCR)

TRUST4: TCR и BCR склопување од RNA-seq податоци

Tcr Receptor Utilities for Solid Tissue (TRUST) е пресметковна алатка за анализа на TCR и BCR секвенци со користење на неизбрани податоци за секвенционирање на РНК, профилирани од цврсти ткива, вклучително и тумори. TRUST4 врши de novo склопување на гените V, J, C вклучувајќи го хиперпроменливата област што ја одредува комплементарноста 3 (CDR3) и известува за консензус на BCR/TCR секвенците. Потоа, TRUST4 ги прерамнува контигите со референтните генски секвенци на IMGT за да ги пријави соодветните информации. TRUST4 поддржува и еднократни и спарени податоци за секвенционирање со која било должина на читање.

Song L, Cohen D, Ouyang Z, Cao Y, Hu X, Shirley Liu X. TRUST4: реконструкција на имунолошкиот репертоар од масовни и едноклеточни RNA-seq податоци. Нат методи. Nature Publishing Group 2021 мај 131–4.

вампир: Длабоки генеративни модели за TCR секвенци

Поставете и тестирајте модели на варијациски автоенкодер (VAE) за секвенците на рецепторот на Т-клетките.

Сеопфатна рамка за анализа за податоци за секвенционирање на репертоарот на Т-клетки и Б-клетки

IEDB: База на податоци и ресурс за анализа на имунолошкиот епитоп

Базата на податоци за имунолошки епитоп (IEDB) е слободно достапен ресурс финансиран од NIAID. Во него се каталогизираат експериментални податоци за антитела и епитопи на Т-клетките проучувани кај луѓе, примати не-човечки и други животински видови во контекст на заразни болести, алергија, автоимунитет и трансплантација. IEDB, исто така, е домаќин на алатки кои помагаат во предвидувањето и анализата на епитопите.

Базата на податоци IPD-IMGT/HLA обезбедува специјализирана база на податоци за секвенците на човечкиот главен комплекс на хистокомпатибилност (MHC) и ги вклучува официјалните секвенци именувани од Комитетот за номенклатура на СЗО за фактори на системот HLA. Базата на податоци IPD-IMGT/HLA е дел од меѓународниот проект ImMunoGeneTics (IMGT).

Базата на податоци ја користи конвенцијата за именување од 2010 година за HLA алели во сите алатки овде. За да се помогне во усвојувањето на новата номенклатура, сите алатки за пребарување може да се користат и со сегашните и со ознаките на алели пред 2010 година. Ознаките на номенклатурата пред 2010 година се користат само кога постарите извештаи или резултати се достапни за преземање.

arcasHLA: Брзо и прецизно во силико заклучување на генотипови HLA од RNA-seq

arcasHLA врши генотипирање со висока резолуција за гените на HLA класа I и класа II од секвенционирањето на РНК, поддржувајќи ги и спарените и еднократните примероци.

HATK: Комплет алатки за анализа на HLA

HATK (HLA Analysis Tool-Kit) е збирка на алатки и модули за извршување на HLA анализа на фино мапирање, која треба да се идентификува кој HLA алел или позиција на аминокиселина на HLA генот ја поттикнува болеста.

HLA-LA: Брзо заклучување на типот HLA од податоците за целиот геном

Впишување HLA врз основа на референтен график за популација и користи нов метод на линеарна проекција за усогласување на читањата со графикот.

HLA-TAPAS: HLA-типирање на протеини за асоцијативни студии

Нафтовод фокусиран на HLA што може да се справи со конструкција на референтни панели на HLA (MakeReference), HLA импутација (SNP2HLA) и HLA асоцијација (HLAassoc). Тоа е ажурирана верзија на SNP2HLA.

HLAProfiler: Користење на k-mers за повикување на HLA алели во податоците за секвенционирање на РНК

HLAProfiler ја користи содржината на k-mer од читањата за секвенционирање од следната генерација за да повика HLA типови во примерок. Врз основа на содржината на k-mer, секој читан пар е доделен на HLA ген и агрегатниот k-mer профил за генот се споредува со референтните k-mer профили за да се одреди типот на HLA. Во моментов HLAProfiler поддржува само спарени RNA-seq податоци.

МАТЕР: Минимизатор RNAseq HLA типувач

Пајтон скрипти и C код

MATER е типувач на HLA базиран на миниматор за RNAseq читана база на податоци. Во типична база на податоци на RNAseq, отчитувањата земени од HLA гените се помалку униформни и може да ги пропуштат регионите што ги прават основните методи за склопување или повикување варијанти за HLA пишување поголем предизвик. Овде прифаќаме малку поинаков пристап. Се обидуваме да го доделиме секое читање на можни HLA типови со користење на миниматори. Имено, ќе генерираме густ минимизатор за секое читање и ќе ги споредиме со оние од секвенците од типот HLA.

Секое читање го припишуваме на можниот HLA серотип или секвенца од 4 цифри според совпаѓањата на минимизирачите. Некои читања може да можат да се доделат на единечна секвенца од типот на HLA, некои други може да бидат понејасни. Изведуваме едноставен резултат за да ги сумираме резултатите од сите читања кои се пресликани со секвенци од типот HLA за секој HLA алел.

MultiHLA: WES HLA пишување базирано на повеќе алтернативни алатки

Овој работен тек овозможува истовремена анализа на WES или WGS податоци со користење на јавно достапен софтвер за да се извлечат HLA хаплотипови од овој тип на податоци. Вклучува автоматизирани работни процеси на Snakemake за следните алатки: xHLA, HLA-VBSeq, OptiType, HLA-LA, arcasHLA

OptiType: Прецизно пишување HLA од податоците за секвенционирање на следната генерација

OptiType е нов алгоритам за генотипирање на HLA базиран на целобројно линеарно програмирање, способен да произведе точни 4-цифрени HLA генотипизирачки предвидувања од податоците од NGS со истовремено избирање на сите главни и помали алели на HLA класа I.

PHLAT: Заклучување на типови HLA со висока резолуција

PHLAT е биоинформатички алгоритам кој нуди HLA пишување со четирицифрена резолуција (или повисока) со користење на податоци за транскриптом и секвенционирање на егзом ширум геном во широк опсег на должини на читање и длабочини на секвенционирање.

seq2HLA: HLA типизација од RNA-Seq секвенцата се чита

In-silico метода напишана во Python и R за одредување на HLA генотипови на примерок. seq2HLA зема стандардно читање на RNA-Seq секвенца во fastq формат како влез, користи индекс на машнички што ги содржи сите HLA алели и ги дава најверојатните HLA класа I и класа II генотипови (во 4 цифрена резолуција), p-вредност за секој повик и изразот на секоја класа.

SNP2HLA: Импутирање на полиморфизми на амино киселини во антигени на човечки леукоцити

SNP2HLA е алатка за импутација на полиморфизми на аминокиселини и полиморфизми на единечни нуклеотиди во хуманите луекоцитни антигени (HLA) во регионот на главниот комплекс на хистокомпатибилност (MHC) во хромозомот 6.


Генерирање на генски модифицирани глувци преку таргетирање на гените посредувани од Cas9/RNA

Групирани редовно меѓупросторни кратки палиндромни повторувања (CRISPR)/CRISPR-асоцирани (Cas) адаптивни имунолошки системи се пронајдени во бактериите и археите за заштита на домаќините од инвазијата на вируси и плазмиди 1,2,3. Идентификувани се три типа (I-III) CRISPR системи со различни карактеристики. Протеинот Cas9 поврзан со CRISPR, кој припаѓа на системот CRISPR/Cas од типот II, привлече големо внимание поради неговата потенцијална употреба во геномското инженерство. Cas9 содржи еден HNH мотив и три мотиви слични на RuvC, хомологни на HNH и RuvC ендонуклеазите, соодветно (Дополнителни информации, Слика S1) 4,5,6,7,8. Неодамнешните студии покажаа дека Cas9 покажува силна активност на расцепување на ДНК кај бактериите и во епруветите. Неговата нуклеазна активност е водена од два некодирачки елементи на РНК на системот, едниот е crRNA (CRISPR RNA) кој содржи околу 20 базни парови (bp) од единствена целна секвенца (наречена секвенца на дистанцирање), а другиот е tracrRNA (транс-активирачка crRNA ). Овие два елементи на РНК формираат crRNA:tracrRNA дуплекс кој го насочува Cas9 кон целната ДНК преку комплементарно базно спарување помеѓу разделувачот на crRNA и комплементарната секвенца (наречена протоспејсер) на целната ДНК. 3-те нуклеотиди (nt) лоцирани веднаш на страната 3 до секвенцата на протоспасерот го сочинуваат соседниот мотив на протопросторот (PAM) кој е потребен за да се обезбеди специфичноста на расцепувањето во целните секвенци 9,10.

Теоретски, CRISPR системите може да се користат кај повисоките еукариоти преку ектопично изразување на ензимот (Cas9) и РНК, слично како нуклеазите од цинк прст (ZFNs) и ефекторните нуклеази слични на активатор на транскрипција (TALENs) (Слика 1А). За да го тестираме ова, прво прашавме дали Cas9 може да изврши расцепување на ДНК кај зебра риба. Генериравме Cas9 оптимизиран со кодон (Дополнителни информации, Табела S1 и податоци S2) и го клониравме во вектор на изразување. Химерна РНК која е единствена инженерска молекула на РНК која ги комбинира карактеристиките на crRNA и tracrRNA 9 е дизајнирана да таргетира една од двете места (EGFP-A и -B) во плазмидот pEGFP-N1 (Слика 1B, Дополнителни информации, слики S2 и S3). Фрагментите на ДНК што одговараат на Cas9 и химеричката РНК беа транскрибирани на РНК ин витро од страна на Т7 РНК полимеразата и Cas9 РНК беше дополнително модифицирана со додавање на капа која е потребна за транслација на 5'-крајот и поли-А опашка на 3'-крајот за да личи на автентична mRNA. Cas9 mRNA, химерична РНК и pEGFP-N1 плазмидот беа ко-инјектирани во едноклеточни ембриони зебра риба. Слични стратегии претходно беа користени за тестирање на активноста на ZFN и TALEN 11,12. Ембрионите беа култивирани 12 часа пред да бидат собрани за целосна екстракција на ДНК.

Таргетирање на гени со посредство на Cas9/RNA. (А) Шематски дијаграм на таргетирање на гени со посредство на Cas9/RNA. Химерната РНК, единствена инженерска молекула на РНК која комбинира crRNA и tracrRNA, може да го води Cas9 да ја расцепи целната локација од ~ 20 nt. PAM, мотивот NGG прикажан во виолетова боја, е суштински за активноста на комплексот. (Б) Шематски приказ на EGFP-A химерична РНК (chiRNA) што се врзува за pEGFP-N1 плазмидот преку секвенца на растојание. PAM е означен со виолетова боја. (C) Химеричката РНК го води Cas9 да го расцепи pEGFP-N1 на целното место кај рибата зебра. Четиристотини нанограми на литар Cas9 mRNA, 100 ng/μl EGFP-A химерична РНК и pEGFP-N1 плазмид беа ко-инјектирани во едноклеточни ембриони од зебра риба. Анализите на расцепување беа направени 12 часа по инјектирањето. Врвовите на стрелките укажуваат дека две ленти на расцепување (околу 295 bp и 198 bp) се откриени во зиготи третирани со Cas9 и не-анилирана EGFP-A химерична РНК. Cas9 и химеричката РНК беа додадени како што е наведено. (Д) Резултати од секвенционирање на T-A колонии на насочени фрагменти засилени од примерокот од лента 4 во В. Две колонии со вметнување 1-bp беа откриени во 48 колонии. Целната низа е напишана со големи букви и означена со црвено. Црвената мала буква претставува низа на вметнување. (Д) PCR засилување на насочен фрагмент во EGFP ген кај основачки глувци третирани со Cas9/RNA микроинјекција. Глувците основачи беа генерирани како што е опишано во Дополнителни информации, Податоци S1. ПЦР засилување на целниот фрагмент беше изведено со користење на геномска ДНК извлечена од опашките на основачите како шаблони. Користените прајмери ​​беа наведени во Дополнителни информации, Слика S2. Стрелката означува скратена лента во основачот #5. Ng, негативна контрола. (F) Производите на PCR од основачот #5 беа подложени на Т-А клонирање. Дваесет колонии беа случајно избрани за секвенционирање на ДНК. Откриено е бришење од 108 bp во девет колонии. Целната низа е напишана со големи букви и означена со црвено.

Целниот регион на EGFP плазмидот беше амплифициран од извлечената ДНК, прочистените производи на PCR потоа беа денатурирани и повторно анулирани за да се формира хибридизирана ДНК, проследено со варење со T7 ендонуклеазата 1 (T7EN1) 13 која може да препознае и расцепи неусогласена ДНК (Дополнителни информации, Слика S4). Електрофорезата со гел на производите за дигестија T7EN1 јасно покажа два помали фрагменти покрај ампликонот на целниот регион, кои не беа забележани во контролата (Слика 1C и Дополнителни информации, слика S3), што сугерира дека целната ДНК била расцепена од Cas9. За прецизно лоцирање на местото на расцепување, ги клониравме производите на PCR и ги анализиравме клоновите со секвенционирање на ДНК. Имаше 2 мутантни клонови од 48 секвенционирани. Сечењето се случи на околу 4 nt оддалеченост од PAM (Слика 1D). Овие резултати покажуваат дека Cas9/RNA може специфично да ја исече ДНК во еукариотските клетки.

За да ја подобриме ефикасноста на сечењето на модулот Cas9 и химеричката РНК, ја заковавме химеричката РНК пред инјектирањето за да го олесниме неговото правилно превиткување. Навистина, анализата на расцепување T7EN1 покажа дека користењето на претходно загреана химерна РНК во системот Cas9 генерира посилни ленти на расцепување. Consistently, more mutants (3 out of 46 PCR clones) were detected by DNA sequencing. Similarly, the cutting occurred about 4 nt away from the PAM (Supplementary information, Figure S5). These results suggest that the conformation of the chimeric RNA probably affects the activity of the Cas9 complex.

Different from prokaryotes, targeting eukaryotic DNA requires nuclear translocation of the nucleases. As expected, when expressed in the mammalian cell line 293T, the prokaryote-derived Cas9 was only detected in cytoplasm despite the addition of an SV40 nuclear localization signal (NLS) to the N- or both the N- and C-termini of Cas9. Even the addition of a triple NLS to the N-terminus did not work (Supplementary information, Figure S6). The reason might be that the NLS peptide was buried or shielded during the folding of the Cas9 protein. To circumvent this, we added a linker (32 amino acids) between the NLS and Cas9, which resulted in the successful nuclear localization of Cas9 (Supplementary information, Figure S6). We tested the cleavage activity of all tagged-Cas9s and found that, as expected, NLS-flag-linker-Cas9 displayed enhanced cleavage activity (Supplementary information, Figure S7).

The cleavage of exogenous DNA in zebrafish embryos encouraged us to test whether Cas9/RNA could be used to site-specifically disrupt endogenous genes in mice, as has been achieved with ZFN and TALEN. We first used the Pouf5-IRES-EGFP knock-in mouse line that carries one copy of the EGFP gene incorporated into the mouse genome. Twenty nanograms per microlitre of NLS-flag-linker-Cas9 mRNA and 20 ng/μl preannealed EGFP-A chimeric RNA were co-injected into one-cell mouse embryos obtained from the crosses between male homozygous Pouf5-IRES-EGFP knock-in mice and superovulated C57BL/6J female mice. Twenty-four injected embryos were transferred into pseudopregnant CD1 female mice and five live animals were born so far. As the Pouf5-IRES-EGFP male mice that we used were homozygous for the knock-in gene, all five founder mice were, as expected, genotyped as heterozygous, indicated by PCR amplification of a knock-in fragment using genomic DNA extracted from the tails of the founders 5 days after birth (Supplementary information, Figure S8). Site-specific cleavage of the endogenous EGFP locus was first analyzed by PCR amplification of the target site using the same tail genomic DNA as used in genotyping. As shown in Figure 1E, a smaller amplicon appeared in founder #5, whereas no mutant bands were detected in the PCR products of founders #1-4. Twenty T-A colonies of the PCR products from founder #5 were randomly picked for DNA sequencing. A 108-bp deletion was detected in nine colonies (Figure 1F). No mutations were detected in the remaining 11 colonies (data not shown). Further analyses by the T7EN1 cleavage assay and DNA sequencing did not detect mutations of the target region in founders #1-4 (data not shown). These results indicate that the Cas9/RNA system induced a site-specific cleavage on endogenous single-copied EGFP. Given the presence of the wild-type amplicon besides the mutant one, fonder #5 is mosaic for the mutant EGFP, which suggests that the cleavage and subsequent repair occurred after the first division of the injected one-cell embryo. It is noteworthy that similar to ZFN and TALEN, Cas9/RNA-induced double-stranded break leads to nonhomologous end joining-mediated repair, which generates indels (insertions or deletions) of different sizes around the DNA break site. The 108-bp deletion within the EGFP gene in the mouse model only represents one case it is likely that more indels of different sizes would be found upon screenings of more founder mice treated with Cas9/RNA.

Next, we tested the efficiency of the same targeting strategy in another EGFP mouse line (CAG-EGFP, with multiple copies of the transgene). Seven pups were born from 51 injected embryos and one of them (#4) contained disrupted EGFP as shown by the T7EN1 cleavage assay (Supplementary information, Figure S9). PCR products from #4 were cloned and sequenced. Eleven out of 50 clones contained mutations. Interestingly, we detected six mutant forms, indicating that Cas9/RNA-mediated cleavage had occurred multiple times on different copies of the EGFP transgene in the same embryo (Supplementary information, Figure S9). Taken together, we demonstrated that Cas9/RNA can induce site-specific cleavage of chromosomal loci in the mouse genome.

In summary, our findings demonstrate that Cas9/RNA can site-specifically cut DNA in zebrafish and mouse embryos, paving the way for its use in the generation of gene-disrupted animals. During the preparation of this manuscript, two papers were published in Науката, reporting the use of the Cas9/RNA system in mammalian cells 14,15 . Our study goes beyond cultured cells and shows the utility of the Cas9/RNA as a genetic tool in generating genetically engineered mice and, potentially, other mammals. Different from ZFN and TALEN, the Cas9/RNA system is RNA-guided and easy to engineer, offering better flexibility as a genomic engineering tool. The fact that this system uses RNA to guide DNA cleavage points to its potential use in large-scale genetic screenings, as a library of guide RNAs can be constructed.


Human chromosome 7: DNA sequence and biology

DNA sequence and annotation of the entire human chromosome 7, encompassing nearly 158 million nucleotides of DNA and 1917 gene structures, are presented. To generate a higher order description, additional structural features such as imprinted genes, fragile sites, and segmental duplications were integrated at the level of the DNA sequence with medical genetic data, including 440 chromosome rearrangement breakpoints associated with disease. This approach enabled the discovery of candidate genes for developmental diseases including autism.

Фигури

DNA sequence comparison of CRA_TCAGchr7.v1…

DNA sequence comparison of CRA_TCAGchr7.v1 against NCBI Build 31. Black circles represent the…

Six mouse chromosomes with synteny…

Six mouse chromosomes with synteny to human chromosome 7, 12 syntenic breakpoints overlapping…

Distribution of 1917 gene structures…

Distribution of 1917 gene structures and 20 putative gene deserts on chromosome 7.

Recent segmental duplications on chromosome…

Recent segmental duplications on chromosome 7. Graphical views (using GenomePixelizer) of paralogous relationships…

The distribution of 1570 cytogenetic…

The distribution of 1570 cytogenetic rearrangement breakpoints (850 constitutional and 720 malignancy-associated) from…

На SHFM1 region at 7q21.3,…

На SHFM1 region at 7q21.3, as an example of information in the chromosome…


THE GENERATION OF ANTIBODY REPERTOIRE: A RISKY DIVERSITY

The error-prone V(D)J recombination process

Ig genes are good candidates to study nonsense RNA surveillance because the generation of primary Ig repertoire in early B-cell development and the process of somatic hypermutations (SHM) in germinal center B cells frequently generate PTCs (1). The V(D)J recombination process of Ig genes takes place in the bone marrow and assembles the variable region from germline variable (V), diversity (D), and joining (J) gene segments. Control of V(D)J recombination occurs at several levels, including cell-type specificity, intra-and inter-locus sequential rearrangements, and allelic exclusion (17). Although DNA rearrangements in the Ig heavy (IgH) and light (т.е. Igκ and Igλ) loci occur in a precise order, the selection of gene segments within each locus is random. It allows for combinatorial diversity. The mechanism used by lymphoid cells to successfully rearrange their antigen (Ag) receptor genes requires the use of recombinase enzymes RAG1 & RAG2 that are only active in lymphocytes (18, 19). Recombinases act at early stages of lymphoid cell development in order to bring two segments into close proximity, forming a loop of intervening DNA which can then be excised. The ends of these segments are annealed to form a newly rearranged DNA sequence. To increase diversity, joining of V, D, and J segments is imprecise with nucleotide deletions or insertions. Non-template (N) nucleotide additions are introduced by terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT). Palindromic (P) insertions occur after asymmetric hairpin opening. Random N-additions cannot be attributed to any other genomic sequences. They rarely exceed a dozen nucleotides (20, 21). They are polymerized by TdT which is the third lymphoid-specific protein involved in V(D)J recombination besides RAG1 and RAG2 (22�). P insertions rarely exceed two nucleotides and form a palindrome with respect to the sequence at the end of the coding strand (26�). Although nucleotide deletions and insertions greatly enlarge the diversity of the Ig repertoire, only one third of all V(D)J junctions are in-frame, while the other two thirds are out-of-frame due to frameshift mutations that create PTCs.

Frequency of PTC-containing Ig genes in B-lineage cells

Clonal selection implies that each B cell clone expresses a unique receptor. Hence, one of the two inherited Ig alleles is functionally rearranged. This allelic exclusion associates asynchronous V(D)J recombination events at Ig loci with receptor-mediated inhibitory feedback control (29). At the pro-B cell stage, VDJ recombination is initiated by biallelic D to J rearrangements at IgH loci, followed by a monoallelic V to DJ recombination. A productive VDJ junction encodes the variable (V) region of the μ heavy chain that can associate with the surrogate light chain to form pre-BCR (pre-B cell receptor). Regulatory mechanisms mediated by pre-BCR signaling prevent further V to DJ rearrangements on the second IgH allele and initiates VJ recombination at Ig light chain loci lacking D segments. By contrast, when the VDJ junction on the first IgH allele is nonproductive, the lack of the pre-BCR inhibitory signal allows V to DJ recombination on the second allele. If this second attempt is successful, a pre-BCR-mediated proliferation wave will generate abundant B cell clones with biallelic VDJ rearrangements. Roughly half of mature B cells harbor biallelic VDJ-rearrangements with a nonproductively-recombined IgH allele (30�). If another nonproductive VDJ junction occurs on the second IgH allele, cells are eliminated through apoptosis. As mentioned above, pre-BCR signaling stimulates recombination of Ig light chain genes. The presence of two Igκ and Igλ light chain isotypes permits multiple VJ recombination events. Again, the expression of a functional BCR precludes further recombination in immature B cells. In humans,

50% of mature B cells express Igλ. However, in mice, recombination takes places preferentially at the Igκ locus and only 5% of B cells express Igλ isotypes (32). Hence, B cells harbor numerous nonproductive VJ-recombined Ig light chain alleles ( Fig. 1 ).

Abundance of nonproductive V(D)J rearrangements in B-lineage cells. (A) Schematic representation of productive and nonproductive V(D)J rearrangements during the generation of primary antibody repertoire. V(D)J recombination is initiated by a monoallelic V to DJ recombination at the IgH locus (biallelic D–J rearrangements are not depicted). If successful, then V to J recombination occurs at Ig light chain (IgL) loci. Successive IgL rearrangements are possible due to the fact that there are two Igκ and two Igλ alleles (not depicted). Pre-B cell receptor (pre-BCR) or BCR-mediated feedback signalling upon in-frame rearrangement of one IgH or IgL allele (т.е., VDJ+ or VJ+) prevents V(D)J recombination on the second allele (32). By contrast, a nonproductive V(D)J recombination on one Ig allele (т.е. VDJ− or VJ−) induces rearrangement on the second allele. The imprecise nature of V(D)J junctions generates

2/3 of nonproductive V(D)J-rearranged alleles. Hence, most B-lineage cells harbour nonproductively-recombined Ig alleles in their genome (red parts in pie charts). If the two attempts on both Ig alleles are unsuccessful, the cell is programmed to die by apoptosis (dashed circles). (B) PTCs introduced during the error-prone V(D)J recombination process (red stars) or by somatic hypermutations (SHM yellow stars) can activate different modes of NMD degradation. Frameshift V(D)J junctions can lead to the appearance of PTCs in the variable (V) exon or in the downstream adjacent constant exon. SHM can lead to the appearance of PTCs in the first leader exon (L1: L-part1) or in the V exon, with a greater abundance in the complement-determining regions (CDRs). For IgH mRNAs, PTC introduced by SHM or during V(D)J recombination can elicit exon junction complex (EJC)-dependent NMD. EJCs that remain bound to mRNAs after a pioneer round of translation are depicted (blue ovals). As good NMD candidates, PTC-containing IgH mRNAs are strongly degraded by NMD (up to 100-fold) (1, 9, 59). However, it has been demonstrated that some nonsense codons in the 5′-half of the VDJ exon could not elicit strong NMD degradation (73). Similarly, PTCs close to the initiation codon are NMD resistant in other models likely due to a critical interaction between PABPC1 with the translation initiation complex (74, 75). For nonproductive Igκ alleles, PTCs are located at the end of the V exon or within the last constant Cκ exon. Hence, these PTC-containing IgL mRNAs could not elicit EJC-dependent NMD degradation, although they are likely to be targeted by a PTC-PABC1 distance-dependent mode of NMD which induces a less efficient degradation (

After their exit from the bone marrow, alternative splicing of constant Cμ and Cδ exons ensures co-expression of IgM and IgD at the surface of naïve B cells (33). Upon antigen encounter, IgD expression is downregulated and activated B cells are subjected to a second wave of Ig gene diversification by SHM in germinal centers (GCs). Frequent nonsense mutations can arise during this affinity maturation process that requires transcription of the target region and enzymatic activity of B-cell-specific activation-induced deaminase AID (34). This process leads to the introduction of multiple nucleotide changes in the V exon (т.е., VDJ or VJ) and a few hundred base pairs in the downstream intron (35). Nucleotide insertions and deletions (indels) have also been observed (36, 37). SHM leads to the expression of a secondary repertoire from which B cells carrying a mutated BCR with improved Ag-binding affinity can be selected (38). We have previously observed that SHM occurs at similar levels on productive and nonproductive VDJ-rearranged IgH alleles (39). If a nonsense codon appears on the productive allele, the lack of Ag-binding activity provokes a rapid elimination of mutated B cell clones within GCs (40�). The occurrence of SHM on nonproductive Ig alleles can introduce additional nonsense codons, modifying the PTC position within the V exon. Class switch recombination (CSR) also occurs in germinal centers. This second round of IgH intragenic rearrangements replaces the Cμ exons with a downstream constant gene (43). GC B cells can differentiate into memory cells or terminally differentiated PCs that secrete substantial amounts of antibody (44). The PC transcriptional program induces major changes including a transcriptional boost of Ig gene transcription and the activation of unfolded protein response (UPR) to ensure proper Ig folding (45). In PCs, the use of secreted polyadenylation signal (PAS) instead of downstream membrane PAS allows alternative IgH pre-mRNA processing to switch from membrane to secreted Ig isoforms (46). Taken together, the vast majority of B-lineage cells harbor PTC+ Ig alleles in their genome with nonsense codons introduced in the V exon or in the adjacent constant exon during the V(D)J recombination process or SHM ( Fig. 1 ).

Transcriptional control of PTC-containing Ig genes

The high frequency of PTC+ V(D)J-rearranged Ig alleles in B-lineage cells needs additional mechanisms to downregulate these nonsense transcripts. A transcriptional silencing of PTC+ Ig genes has been proposed as a primary mechanism preventing their expression. This mechanism is called “nonsense-mediated transcriptional gene silencing” (NMTGS). It involves chromatin remodelling and “heterochromatinization” of the PTC+ DNA sequence. NMTGS can be inhibited by the overexpression of exonuclease. However, the involvement of siRNA like molecules has not been elucidated yet (4). NMTGS is also impaired upon knock-down of the main NMD factor UPF1, suggesting a mechanistic link between NMD and NMTGS (47). Although NMTGS has been demonstrated in Hela cells transfected with minigene constructs, the occurrence of such a quality control mechanism needs to be determined in B cells. Instead of active silencing, many studies including ours have shown a biallelic transcription pattern for productive and nonproductive Ig alleles in B cells (9, 39, 48�). To study the transcription and RNA surveillance of PTC+ IgH alleles during B cell development, we introduced a nonsense V exon in the IgH locus to specifically mark each allele in heterozygous mutants. Consistent with previous observations in a pro-B cell line (52), productive and nonproductive IgH alleles exhibited equivalent transcription rates with similar RNAPII loading in LPS-stimulated B cells (9, 48). This also confirms our earlier study in germinal center B cells, demonstrating that the frequency of transcription-dependent SHM is similar for productive and nonproductive VDJ-recombined IgH alleles (39).


Memory deficits, gait ataxia and neuronal loss in the hippocampus and cerebellum in mice that are heterozygous for Pur-alpha

Pur-alpha is a highly conserved sequence-specific DNA and RNA binding protein with established roles in DNA replication, RNA translation, cell cycle regulation, and maintenance of neuronal differentiation. Prior studies have shown that mice lacking Pur-alpha (-/-) display decreased neurogenesis and impaired neuronal differentiation. We sought to examine for the first time, the behavioral phenotype and brain histopathology of mice that are heterozygous (+/-) for Pur-alpha. Standardized behavioral phenotyping revealed a decreased escape response to touch, limb and abdominal hypotonia, and gait abnormalities in heterozygous Pur-alpha (+/-) mice, compared to wild-type (+/+) littermates. Footprint pattern analyses showed wider-based steps, increased missteps and more outwardly rotated hindpaws in heterozygous Pur-alpha (+/-) mice, suggestive of cerebellar pathology. The Barnes maze and novel object location testing revealed significant memory deficits in heterozygous Pur-alpha mice, suggestive of hippocampal pathology. Quantitative immunohistochemical assays of the vermal region of the cerebellum and CA1-3 regions of the hippocampus revealed reduced numbers of neurons in general, as well as reduced numbers of Pur-alpha+-immunopositive neurons and dendrites in heterozygous Pur-alpha mice, compared to wild-type littermates. Past studies have implicated mutations in Pur-alpha in several diseases of brain development and neurodegeneration. When combined with these new findings, the Pur-alpha heterozygous knockout mice may provide an animal model to study mechanisms of and treatments for Pur-alpha-related cognitive deficiencies and neuropathology.

Клучни зборови: PURA animals brain pathology knockout mice puralpha.

Copyright © 2016 IBRO. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.

Фигури

Select results (neural reflexes and…

Select results (neural reflexes and open field activities) from a general health screen.…

Gait abnormalities were evident in…

Gait abnormalities were evident in heterozygous Pur-alpha (+/−) mice during forward walking. (А)…

Assessment of memory abilities in…

Assessment of memory abilities in novel object location and novel object recognition assays…

Assessment of memory abilities in…

Assessment of memory abilities in a Barnes maze test at 24 hours after…

Further assessment of memory abilities…

Further assessment of memory abilities in Barnes maze tests. Animals were trained for…

Reduced Pur-alpha immunostained neurons and…

Reduced Pur-alpha immunostained neurons and dendrites in hippocampus and cerebellum of mature (11…

Reduced numbers of Pur-alpha immunostained…

Reduced numbers of Pur-alpha immunostained neurons and dendrites in hippocampus, cerebellum and amygdala…


DNA methylation alters transcriptional rates of differentially expressed genes and contributes to pathophysiology in mice fed a high fat diet

Цел: Overnutrition can alter gene expression patterns through epigenetic mechanisms that may persist through generations. However, it is less clear if overnutrition, for example a high fat diet, modifies epigenetic control of gene expression in adults, or by what molecular mechanisms, or if such mechanisms contribute to the pathology of the metabolic syndrome. Here we test the hypothesis that a high fat diet alters hepatic DNA methylation, transcription and gene expression patterns, and explore the contribution of such changes to the pathophysiology of obesity.

Методи: RNA-seq and targeted high-throughput bisulfite DNA sequencing were used to undertake a systematic analysis of the hepatic response to a high fat diet. RT-PCR, chromatin immunoprecipitation and in vivo knockdown of an identified driver gene, Phlda1, were used to validate the results.

Резултати: A high fat diet resulted in the hypermethylation and decreased transcription and expression of Phlda1 and several other genes. A subnetwork of genes associated with Phlda1 was identified from an existing Bayesian gene network that contained numerous hepatic regulatory genes involved in lipid and body weight homeostasis. Hepatic-specific depletion of Phlda1 in mice decreased expression of the genes in the subnetwork, and led to increased oil droplet size in standard chow-fed mice, an early indicator of steatosis, validating the contribution of this gene to the phenotype.

Заклучоци: We conclude that a high fat diet alters the epigenetics and transcriptional activity of key hepatic genes controlling lipid homeostasis, contributing to the pathophysiology of obesity.

Клучни зборови: DNA methylation High fat diet Liver Phlda1 RNA-seq Transcription.


DNA repair is essential for cell vitality, cell survival, and cancer prevention, yet cells’ ability to patch up damaged DNA declines with age for reasons not fully understood.

Now, research led by scientists at Harvard Medical School (HMS) reveals a critical step in a molecular chain of events that allows cells to mend their broken DNA.

The findings, to be published March 24 in Science, offer a critical insight into how and why the body’s ability to fix DNA dwindles over time and point to a previously unknown role for the signaling molecule NAD as a key regulator of protein-to-protein interactions in DNA repair. NAD, identified a century ago, is already known for its role as a controller of cell-damaging oxidation.

Additionally, experiments conducted in mice show that treatment with the NAD precursor NMN mitigates age-related DNA damage and wards off DNA damage from radiation exposure.

Unraveling the mysteries of aging

The scientists caution that the effects of many therapeutic substances are often profoundly different in mice and humans owing to critical differences in biology. However, if affirmed in further animal studies and in humans, the findings can help pave the way to therapies that prevent DNA damage associated with aging and with cancer treatments that involve radiation exposure and some types of chemotherapy, which, along with killing tumors, can cause considerable DNA damage in healthy cells. Human trials with NMN are expected to begin within six months, the researchers said.

“Our results unveil a key mechanism in cellular degeneration and aging, but beyond that they point to a therapeutic avenue to halt and reverse age-related and radiation-induced DNA damage,” said senior author David Sinclair, professor in the Department of Genetics at HMS, co-director of the Paul F. Glenn Center for the Biology of Aging, and professor at the University of New South Wales School of Medicine in Sydney.

A previous study led by Sinclair showed that NMN reversed muscle aging in mice.

A plot with many characters

The investigators started by looking at a cast of proteins and molecules suspected to play a part in the cellular aging process. Some of them were well-known characters, others more enigmatic figures.

The researchers already knew that NAD, which declines steadily with age, boosts the activity of the SIRT1 protein, which delays aging and extends life in yeast, flies, and mice. Both SIRT1 and PARP1, a protein known to control DNA repair, consume NAD in their work.

Another protein, DBC1, one of the most abundant proteins in humans and found across life forms from bacteria to plants and animals, was a far murkier presence. Because DBC1 previously had been shown to inhibit vitality-boosting SIRT1, the researchers suspected DBC1 may also somehow interact with PARP1, given the similar roles PARP1 and SIRT1 play.

“We thought if there is a connection between SIRT1 and DBC1, on one hand, and between SIRT1 and PARP1 on the other, then maybe PARP1 and DBC1 were also engaged in some sort of intracellular game,” said Jun Li, first author on the study and a research fellow in the Department of Genetics at HMS.

To get a better sense of the chemical relationship among the three proteins, the scientists measured the molecular markers of protein-to-protein interaction inside human kidney cells. DBC1 and PARP1 bound powerfully to each other. However, when NAD levels increased, that bond was disrupted. The more NAD was present inside cells, the fewer molecular bonds PARP1 and DBC1 could form. When researchers inhibited NAD, the number of PARP1-DBC1 bonds went up. In other words, when NAD is plentiful, it prevents DBC1 from binding to PARP1 and meddling with its ability to mend damaged DNA.

What this suggests, the researchers said, is that as NAD declines with age, fewer and fewer NAD molecules are around to stop the harmful interaction between DBC1 and PARP1. The result: DNA breaks go unrepaired and, as these breaks accumulate over time, precipitate cell damage, cell mutations, cell death, and loss of organ function.

Averting mischief

Next, to understand how exactly NAD prevents DBC1 from binding to PARP1, the team homed in on a region of DBC1 known as NHD, a pocket-like structure found in some 80,000 proteins across life forms and species whose function has eluded scientists. The team’s experiments showed that NHD is an NAD binding site and that in DBC1, NAD blocks this specific region to prevent DBC1 from locking in with PARP1 and interfering with DNA repair.

Sinclair said that since NHD is so common across species, the finding suggests that by binding to it, NAD may play a similar role averting harmful protein interactions across many species to control DNA repair and other cell survival processes.

Поврзани


1. Xiong N, Raulet DH. Development and selection of gammadelta T cells. Immunol Rev (2007) 215:15�. doi:10.1111/j.1600-065X.2006.00478.x

2. Schatz DG, Ji Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Нат Рев Имунол (2011) 11:251�. doi:10.1038/nri2941

3. Davis MM, Boniface JJ, Reich Z, Lyons D, Hampl J, Arden B, et al. Ligand recognition by alpha beta T cell receptors. Annu Rev Immunol (1998) 16:523�. doi:10.1146/annurev.immunol.16.1.523

4. Arstila TP, Casrouge A, Baron V, Even J, Kanellopoulos J, Kourilsky P. A direct estimate of the human alphabeta T cell receptor diversity. Науката (1999) 286:958�. doi:10.1126/science.286.5441.958

5. Sherwood AM, Emerson RO, Scherer D, Habermann N, Buck K, Staffa J, et al. Tumor-infiltrating lymphocytes in colorectal tumors display a diversity of T cell receptor sequences that differ from the T cells in adjacent mucosal tissue. Cancer Immunol Immunother (2013) 62:1453�. doi:10.1007/s00262-013-1446-2

6. Kirsch IR, Watanabe R, O’Malley JT, Williamson DW, Scott LL, Elco CP, et al. TCR sequencing facilitates diagnosis and identifies mature T cells as the cell of origin in CTCL. Sci Transl Med (2015) 7:308ra158. doi:10.1126/scitranslmed.aaa9122

7. Acha-Orbea H, Mitchell DJ, Timmermann L, Wraith DC, Tausch GS, Waldor MK, et al. Limited heterogeneity of T cell receptors from lymphocytes mediating autoimmune encephalomyelitis allows specific immune intervention. Ќелија (1988) 54:263�. doi:10.1016/0092-8674(88)90558-2

8. Dziubianau M, Hecht J, Kuchenbecker L, Sattler A, Stervbo U, Rodelsperger C, et al. TCR repertoire analysis by next generation sequencing allows complex differential diagnosis of T cell-related pathology. Am J Transplant (2013) 13:2842�. doi:10.1111/ajt.12431

9. Hou D, Chen C, Seely EJ, Chen S, Song Y. High-throughput sequencing-based immune repertoire study during infectious disease. Преден имунол (2016) 7:336. doi:10.3389/fimmu.2016.00336

10. Faint JM, Pilling D, Akbar AN, Kitas GD, Bacon PA, Salmon M. Quantitative flow cytometry for the analysis of T cell receptor Vbeta chain expression. J Immunol Methods (1999) 225:53�. doi:10.1016/S0022-1759(99)00027-7

11. Cochet M, Pannetier C, Regnault A, Darche S, Leclerc C, Kourilsky P. Molecular detection and in vivo analysis of the specific T cell response to a protein antigen. Eur J Immunol (1992) 22:2639�. doi:10.1002/eji.1830221025

12. Sant𠆚ngelo DB, Lucas B, Waterbury PG, Cohen B, Brabb T, Goverman J, et al. A molecular map of T cell development. Имунитет (1998) 9:179�. doi:10.1016/S1074-7613(00)80600-7

13. Correia-Neves M, Waltzinger C, Mathis D, Benoist C. The shaping of the T cell repertoire. Имунитет (2001) 14:21�. doi:10.1016/S1074-7613(01)00086-3

14. Tumeh PC, Harview CL, Yearley JH, Shintaku IP, Taylor EJ, Robert L, et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Природата (2014) 515:568�. doi:10.1038/nature13954

15. Linnemann C, Heemskerk B, Kvistborg P, Kluin RJ, Bolotin DA, Chen X, et al. High-throughput identification of antigen-specific TCRs by TCR gene capture. Nat Med (2013) 19:1534�. doi:10.1038/nm.3359

16. Ruggiero E, Nicolay JP, Fronza R, Arens A, Paruzynski A, Nowrouzi A, et al. High-resolution analysis of the human T-cell receptor repertoire. Nat Commun (2015) 6:8081. doi:10.1038/ncomms9081

17. Zhu YY, Machleder EM, Chenchik A, Li R, Siebert PD. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Биотехники (2001) 30:892𠄷.

18. Robins HS, Campregher PV, Srivastava SK, Wacher A, Turtle CJ, Kahsai O, et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor beta-chain diversity in alphabeta T cells. Крв (2009) 114:4099�. doi:10.1182/blood-2009-04-217604

19. Madi A, Shifrut E, Reich-Zeliger S, Gal H, Best K, Ndifon W, et al. T-cell receptor repertoires share a restricted set of public and abundant CDR3 sequences that are associated with self-related immunity. Genome Res (2014) 24:1603�. doi:10.1101/gr.170753.113

20. van Heijst JW, Ceberio I, Lipuma LB, Samilo DW, Wasilewski GD, Gonzales AM, et al. Quantitative assessment of T cell repertoire recovery after hematopoietic stem cell transplantation. Nat Med (2013) 19:372𠄷. doi:10.1038/nm.3100

21. Bergman Y. Allelic exclusion in B and T lymphopoiesis. Semin Immunol (1999) 11:319�. doi:10.1006/smim.1999.0188

22. Kim SM, Bhonsle L, Besgen P, Nickel J, Backes A, Held K, et al. Analysis of the paired TCR alpha- and beta-chains of single human T cells. PLoS One (2012) 7:e37338. doi:10.1371/journal.pone.0037338

23. Han A, Glanville J, Hansmann L, Davis MM. Linking T-cell receptor sequence to functional phenotype at the single-cell level. Нат биотехнол (2014) 32:684�. doi:10.1038/nbt.2938

24. Howie B, Sherwood AM, Berkebile AD, Berka J, Emerson RO, Williamson DW, et al. High-throughput pairing of T cell receptor alpha and beta sequences. Sci Transl Med (2015) 7:301ra131. doi:10.1126/scitranslmed.aac5624

25. Ho SN, Hunt HD, Horton RM, Pullen JK, Pease LR. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. ген (1989) 77:51𠄹. doi:10.1016/0378-1119(89)90358-2

26. Turchaninova MA, Britanova OV, Bolotin DA, Shugay M, Putintseva EV, Staroverov DB, et al. Pairing of T-cell receptor chains via emulsion PCR. Eur J Immunol (2013) 43:2507�. doi:10.1002/eji.201343453

27. Munson DJ, Egelston CA, Chiotti KE, Parra ZE, Bruno TC, Moore BL, et al. Identification of shared TCR sequences from T cells in human breast cancer using emulsion RT-PCR. Proc Natl Acad Sci U S A (2016) 113:8272𠄷. doi:10.1073/pnas.1606994113

28. McDaniel JR, DeKosky BJ, Tanno H, Ellington AD, Georgiou G. Ultra-high-throughput sequencing of the immune receptor repertoire from millions of lymphocytes. Nat Protoc (2016) 11:429�. doi:10.1038/nprot.2016.024

29. Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, Reinius B, Guillaumet-Adkins A, Smets M, et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Mol Cell (2017) 65:631�.e4. doi:10.1016/j.molcel.2017.01.023

30. Satija R, Shalek AK. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends Immunol (2014) 35:219�. doi:10.1016/j.it.2014.03.004

31. Saliba AE, Westermann AJ, Gorski SA, Vogel J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res (2014) 42:8845�. doi:10.1093/nar/gku555

32. Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Ќелија (2015) 161:1202�. doi:10.1016/j.cell.2015.05.002

33. Klein AM, Mazutis L, Akartuna I, Tallapragada N, Veres A, Li V, et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Ќелија (2015) 161:1187�. doi:10.1016/j.cell.2015.04.044

34. Stubbington MJT, Lonnberg T, Proserpio V, Clare S, Speak AO, Dougan G, et al. T cell fate and clonality inference from single-cell transcriptomes. Nat Methods (2016) 13:329�. doi:10.1038/nmeth.3800

35. De Simone M, Arrigoni A, Rossetti G, Gruarin P, Ranzani V, Politano C, et al. Transcriptional landscape of human tissue lymphocytes unveils uniqueness of tumor-infiltrating T regulatory cells. Имунитет (2016) 45:1135�. doi:10.1016/j.immuni.2016.10.021

36. Plitas G, Konopacki C, Wu K, Bos PD, Morrow M, Putintseva EV, et al. Regulatory T cells exhibit distinct features in human breast cancer. Имунитет (2016) 45:1122�. doi:10.1016/j.immuni.2016.10.032

37. Zheng C, Zheng L, Yoo JK, Guo H, Zhang Y, Guo X, et al. Landscape of infiltrating T cells in liver cancer revealed by single-cell sequencing. Ќелија (2017) 169:1342�.e16. doi:10.1016/j.cell.2017.05.035

38. Redmond D, Poran A, Elemento O. Single-cell TCRseq: paired recovery of entire T-cell alpha and beta chain transcripts in T-cell receptors from single-cell RNAseq. Genome Med (2016) 8:80. doi:10.1186/s13073-016-0335-7

39. Afik S, Yates KB, Bi K, Darko S, Godec J, Gerdemann U, et al. Targeted reconstruction of T cell receptor sequence from single cell RNA-seq links CDR3 length to T cell differentiation state. Nucleic Acids Res (2017) 45:e148. doi:10.1093/nar/gkx615

40. Eltahla AA, Rizzetto S, Pirozyan MR, Betz-Stablein BD, Venturi V, Kedzierska K, et al. Linking the T cell receptor to the single cell transcriptome in antigen-specific human T cells. Immunol Cell Biol (2016) 94:604�. doi:10.1038/icb.2016.16

41. Zemmour D, Zilionis R, Kiner E, Klein AM, Mathis D, Benoist C. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nat Immunol (2018) 19:291�. doi:10.1038/s41590-018-0051-0

Keywords: T cell receptor repertoire, RNA sequencing, single cell analysis, bioinformatics, immune system

Citation: De Simone M, Rossetti G and Pagani M (2018) Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Напред. Имунол. 9:1638. doi: 10.3389/fimmu.2018.01638

Received: 09 April 2018 Accepted: 03 July 2018
Published: 18 July 2018

Fabio Luciani, University of New South Wales, Australia

Avinash Bhandoola, National Institutes of Health (NIH), United States
John Stephen Bridgeman, Cellular Therapeutics Ltd., United Kingdom

Copyright: © 2018 De Simone, Rossetti and Pagani. Ова е напис со отворен пристап дистрибуиран според условите на лиценцата за наведување на извор на Криејтив комонс (CC BY). Употребата, дистрибуцијата или репродукцијата на други форуми е дозволена, под услов оригиналниот автор(и) и сопственикот(ите) на авторските права да бидат заслужни и дека оригиналната публикација во ова списание е цитирана, во согласност со прифатената академска практика. Не е дозволена употреба, дистрибуција или репродукција што не е во согласност со овие услови.


Погледнете го видеото: Try Not To Laugh Challenge - Funny Cat u0026 Dog Vines compilation 2017 (Јуни 2022).


Коментари:

  1. Mai

    Полесно при вртење!

  2. Cedro

    Ти си апсолутно во право. In it something is also to me it seems it is excellent idea. Се согласувам со тебе.

  3. Tovi

    Сметам, дека не сте во право. Можам да го докажам тоа. Пишете ми во премиерот, ќе разговараме.



Напишете порака