Информации

3.7: Анализа на однесувањето на протеините - Биологија

3.7: Анализа на однесувањето на протеините - Биологија



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Вовед

Денес ќе добиете криви на титрација против калциум за вашите диви и мутантни протеини со помош на автоматски читач на флуоресцентни плочи. Излезот е мрежа до 96 флуоресцентни вредности, за редовите A-G и колоните 1-12, што е подложна на анализа со програма како Excel.

Со цел дополнително да имате корист од овој формат за тестирање со висока пропусност, ќе се дружите со повеќеканалната пипета, чисто механичка, а не дигитална помош за повторувачки експерименти. Оваа алатка ви овозможува да вшмукувате и исфрлите еквивалентни волумени на повеќе идентични примероци (обично 8-12 во исто време) со само еден удар. Ќе го користите овој тип на пипета за да го наполните секој ред од микротитарната плоча со еден вид протеински примерок и секоја колона со различна концентрација на калциум. Иако повеќеканалната пипета може да биде доволна за типична истражувачка лабораторија, во фармацевтските компании кои можеби анализираат илјадници примероци дневно, сепак потребни се повеќе чекори на автоматизација и зголемување, како што се роботски краци на пипети кои ја избегнуваат потребата за рачно пипетирање на сите. Степенот на автоматизација кој е комерцијално достапен, или развиен „во куќата“ во одредена лабораторија или корпорација, делумно зависи од фреквенцијата со која се користи одредена анализа. Анализите што се користат од многу различни лаборатории и компании (како што се флуоресцентна или апсорпциона спектрофотометрија) најверојатно ќе создадат комерцијално достапни машини со висока пропусна моќ.

Иако концептот на скала е прагматичен проблем, можеби посуштинска тема од интерес за нас денес е довербата во нашите резултати. Како што веројатно сте добро свесни, секоја манипулација и мерење што ги правите во лабораторија има грешка поврзана со неа. На пример, разгледајте го сеприсутниот пипетмен P200. Според еден производител на пипети, неговата точност е 1% (малку полоша при најниските волумени). Така, обидот да се пипетира 100 μL ќе резултира со вистински волумен од 99-101 μL само од грешката на инструментот, што може дополнително да се надополни од заспаниот оператор на пипета, да речеме. Прецизноста на пипетата е типично подобра од нејзината точност, 0,25% за примерот даден погоре. Прецизноста се однесува на репродуктивноста на даденото мерење, а не на неговата апсолутна точност. Овој едноставен пример ги покажува општите принципи применливи за други видови грешки.

Ќе се обидете да ја сфатите севкупната грешка на денешниот експеримент со извршување на вашите протеински примероци во дупликат. Односно, за секоја комбинација протеин-калциум, ќе извршите две независни мерења. Овие мерења потоа може да се просечно измерат за да се изедначат вашите податоци и се надеваме дека ќе се подобри односот сигнал/шум - каде што сигналот овде се однесува на вистинските разлики помеѓу примероците измешани со различни количини на калциум, а бучавата значи вродени флуктуации во системот поради грешка. Бучавата во овој експеримент може да се однесува и на позадинската флуоресценција на тампонот на примерокот. Така, друг начин да се одржи разумен сооднос сигнал:шум е со одржување на нашиот протеин прилично концентриран, така што апсолутните вредности на флуоресценција што ги добиваме се високи во споредба со позадината. Сликата десно ги покажува горенаведените концепти. Распрснувањето во податоците (не сите кругови се на иста висина) е еден вид бучава. Нивото на заднина е друг вид на шум: податоците од левата страна имаат релативно низок сигнал и со тоа слаб сооднос сигнал:шум, додека податоците од десната страна имаат релативно висок апсолутен сигнал и подобрен сооднос сигнал:шум.

Протоколи

Денеска во лабораторија ќе работат само 2-3 групи истовремено. Последен пат требаше да се пријавите за блок од еден час.

Дел 1: Набљудување на протеински гел

Доколку сакате, погледнете го вашиот гел обоен со Coomassie од претходната лабораторија.

Совети за успех

Внимавајте денес да го ограничите внесувањето меурчиња во вашите примероци. При исфрлање на течност, пипетајте полека додека го допирате врвот на пипетата на дното или на страната на бунарот. Кога ја користите повеќеканалната пипета, секогаш проверувајте дали сите врвови се полнат - понекогаш едниот врв може да не е до крај, и ќе повлече помал волумен од другите. Ако тоа се случи, ослободете ја течноста, прилагодете го врвот и обидете се повторно.

Протокол

  1. Земете црна чинија со 96 бунари и запознајте се со шемата десно: горните два реда се од див тип, следните два реда се мутантот M124S, а последните два се вашиот сопствен мутант.
    • Темните страни на плочата го намалуваат „вкрстеното истекување“ (т.е. истекување на светлина) помеѓу примероците во соседните бунари, што е уште еден потенцијален придонес за грешка.
  2. Пренесете дел од протеин од див тип во пластичен резервоар. Користете ја повеќеканалната пипета за да додадете 30 μL протеин (по бунар) во горните два реда од вашата чинија.
  3. Земете свеж резервоар и повторете го чекор 2 за вашите мутантни протеини, додавајќи го секој во соодветно означените редови.
  4. Конечно, додадете обичен EB пуфер (без протеин) во седмиот ред од плочата, користејќи го заедничкиот посветен резервоар. (Зошто мислите дека вклучуваме низа решенија без протеини?)
  5. Користејќи го заедничкиот резервоар 1 (најниска концентрација на калциум), додадете 30 μL во горните седум редови во првата колона од плочата. Фрлете ги врвовите на пипетите.
  6. Сега одете од резервоарите 2 до 12 (највисока концентрација на калциум) и од левата страна до десните столбови на вашата чинија. Не заборавајте да користите свежи врвови за пипети секој пат! Ако контаминирате решение, известете го наставниот факултет за да можат да изнесат ново решение.
  7. На крај, покријте ја чинијата со парафилм и завиткајте ја во алуминиумска фолија.

Дел 2: Флуоресцентна анализа

  1. BPEC (Центарот за инженерство на биолошки процеси) љубезно се согласи да ни дозволи да го користиме нивниот читач на плочи. Одете до просторијата за инструменти BPEC со член на наставниот кадар.
  2. Ќе ви биде прикажано како да ја поставите брановата должина на возбудата (485 nm) и емисијата (515 nm) на читачот на плочата за да го анализирате вашиот протеин.
  3. Вашите необработени податоци ќе бидат објавени или испратени до вас преку е-пошта; алтернативно, можете да донесете сопствен флеш диск за веднаш да ги вратите податоците.

За следниот пат

  1. Подгответе слика и наслов за вашите резултати од SDS-PAGE. Побарајте ја очекуваната молекуларна тежина користејќи го документот IPC секвенца и ова онлајн Молекуларна тежина на протеини алатка (или слична) веб-страница. Не заборавајте да додадете ~ 3 KDa за големината на N-крајот на pRSET (Неговата ознака, итн.). Ако видите два силни бендови, што мислите дека е вториот? Оваа домашна задача ќе биде оценета за време на часот следниот пат за да можете да вклучите какви било коментари во вашиот конечен извештај.

Различни инженерски апликации се искористени за испорака на молекули и соединенија и во вродени и во биолошки услови. Во контекст на биолошките апликации, навремената испорака на молекули може да биде критична за клеточната и органската функција. Како такви, претходните студии ја покажаа супериорноста на долгорочната испорака на протеини, по пат на врзување на протеините на биоинженерните скелиња, во споредба со конвенционалната испорака на растворливи протеини ин витро и in vivo. И покрај ваквите придобивки, постојат малку знаења во врска со стабилноста, кинетиката на ослободување, долговечноста, активирањето на интрацелуларната патека и функционалноста на овие протеини со текот на времето. На пример, овде ја испитавме стабилноста, деградацијата и функционалноста на протеинот, невротрофичен фактор (GDNF) добиен од глијали, за кој е познато дека влијае на преживувањето на невроните, диференцијацијата и морфогенезата на невритите. Ензимски имуносорбентните анализи (ELISA) открија дека GDNF, ковалентно врзан на поликапролактонски (PCL) нанофиброзни скелиња, остана присутен на површината на скелето 120 дена, без докази за истекување или разградување на протеините. Врзаниот GDNF протеин остана функционален и способен да активира низводно сигнални каскади, како што е откриено со неговиот капацитет да го фосфорилира интрацелуларниот Erk во нервната клеточна линија. Понатаму, имобилизацијата на протеинот GDNF го промовираше преживувањето и диференцијацијата на клетките во културата на 3 и 7 дена, дополнително потврдувајќи ја продолжената функционалност на протеинот, многу повеќе од временската рамка од минути до часови забележана за растворливи протеини под исти услови на култура. Оваа студија обезбедува важен доказ за кинетиката на стабилноста и функционалноста на врзаните молекули.

Ова истражување беше поддржано со финансирање од Австралискиот совет за истражување, Фондацијата за истражување на Бетлеем Грифит и Фондот за големиот комитет за опрема на австралискиот национален универзитет.

И двајцата автори подеднакво придонесоа за ова дело.


Позадина

Локомоцијата е потребна за локализација на храната и партнерите, бегството од предатори, одбраната на територијата и одговорот на стресот, и затоа е составен дел на повеќето однесувања на животните. Кај луѓето, Паркинсоновата болест, Хантингтоновата болест, нарушувањата на активноста и депресијата се поврзани со дефицит во движењето. Така, разбирањето на генетската архитектура на локомоторното однесување е важно од двојната перспектива на еволутивната биологија и човековото здравје.

Локомоцијата е сложено однесување, со варијации во природата кои се припишуваат на повеќе интерактивни квантитативни локуси на особини (QTL) со индивидуално мали ефекти, чиј израз е чувствителен на околината [1]. Дисекцијата на генетската архитектура на сложеното однесување е многу олеснета кај моделните организми, како на пр Drosophila melanogaster, каде што може да се проценат ефектите на мутациите за да се заклучи кои гени се потребни за манифестација на однесувањето и да се мапира QTL што влијае на природните варијации со висока резолуција [2]. Општите карактеристики на генетската архитектура на сложените однесувања веројатно ќе бидат рекапитулирани низ различни таксони. Основните биолошки процеси, вклучувајќи го и развојот на нервниот систем, се еволутивно зачувани помеѓу мувите и цицачите [3]. Така, ортолози на гени кои влијаат Дрософила движењето може да биде релевантно кај луѓето. На пример, Паркинсоновата болест е поврзана со прогресивна дегенерација на нигростриаталните допаминергични неврони [4, 5], а допаминот исто така е вмешан во движењето на глувците [6] и Дрософила [1, 7–12].

Неколку студии ја откриваат основната генетска сложеност на локомоторното однесување во Дрософила. Невротрансмитерите серотонин (5-хидрокситриптамин) [13], октопамин (безрбетниот хомолог на норадреналин) [14] и γ-аминобутерна киселина [15] влијаат Дрософила локомоција како и гените потребни за правилен невроанатомски развој на телата на печурките и компонентите на централниот комплекс, мозочните региони потребни за нормална локомоција [16-21]. Неодамна, развивме анализа со висока пропусна моќ за да ја квантифицираме компонентата „локомоторна реактивност“ на локомоторното однесување (мерено со нивото на активност веднаш по механичко нарушување), и го искористивме ова за да го мапираме QTL сегрегирањето помеѓу две вродени линии кои имаа значително различни нивоа на локомоторна реактивност [1]. Идентификувавме 13 позиционирани кандидатски гени кои одговараат на QTL. Познато е дека три од овие гени влијаат на движењето на возрасните, шест имале мутант фенотипови во согласност со вклученоста во регулирањето на движењето, иако ефектите врз локомоторното однесување не биле квантифицирани претходно, а преостанатите четири гени, сите ги кодираат факторите на транскрипција на РНК полимераза II вмешани во развојот на нервниот систем. беа нови кандидатски гени кои влијаат на локомоторното однесување. Оваа студија ја нагласува моќта на користење на природни алелни варијанти за проучување на сложеното однесување [22], но беше ограничена на идентификување на гени кои се сегрегираат во двете употребени родителски линии, кои претставуваат ограничен примерок на алели кои се сегрегираат во природна популација.

Алтернативна стратегија за откривање на гени кои влијаат на сложените однесувања е да се комбинира вештачката селекција за дивергентни фенотипови со профилирање на експресијата на целиот геном [23-28]. Образложението на овој пристап е дека гените кои покажуваат конзистентни промени во експресијата како корелиран одговор на селекцијата се кандидатски гени кои влијаат на избраната особина. Оваа стратегија има две предности во споредба со традиционалните парадигми за мапирање на QTL и непристрасните екрани за мутации кои влијаат на карактеристиките на однесувањето. Прво, иницирањето вештачка селекција од голема базна популација неодамна изведена од природата гарантира дека е вклучен поголем и порепрезентативен примерок на алели кои влијаат на сегрегирачката варијација во однесувањето отколку во студиите за мапирање QTL кои користат две родителски линии. Второ, проценката на бихејвиоралните ефекти на мутациите во кандидатските гени чиешто изразување е ко-регулирано во генетски дивергентните линии е поефикасно од непристрасните мутациски екрани за идентификација на гените кои влијаат на карактеристиката од интерес [23, 26, 27]. Овде, ја комбиниравме оваа стратегија со класична квантитативна генетска анализа за дополнително да ја разбереме генетската архитектура на локомоторната реактивност. Создадовме линии за вештачка селекција од генетски хетерогена позадина и селектиравме за 25 генерации за да изведеме реплицирани линии со зголемени и намалени нивоа на локомоторна реактивност, како и неизбрани контролни линии. Ја измеривме и локомоторната реактивност кај популација од 340 вродени линии добиени од истата природна популација. Потоа користевме профилирање на експресијата на целиот геном за да го квантифицираме пакетот гени што беа различно изразени помеѓу линиите за селекција. Функционалните тестови на мутации во десет од диференцијално изразените гени идентификуваа седум нови кандидатски гени кои влијаат на локомоторното однесување.


Резултати

SERBP1 е нов прогностички маркер во GBM

Ја проценивме улогата на SERBP1 како онкоген фактор кај глиом/GBM и неговото потенцијално влијание врз преживувањето на пациентот и одговорот на терапијата. Во мултиткивната транскриптомска анализа извршена со базата на податоци GTEx [21], мозочните ткива покажуваат намалена SERBP1 mRNA експресија додека две трансформирани клеточни линии (LCL и FIBRBLS) покажаа највисоки нивоа (сл. 1а). Имено, SERBP1 покажува повисока експресија во GBM (TCGA примероци) во споредба со нормалниот мозок и LGG (глиом со низок степен, степен II) (сл. 1b, c, дополнителна датотека 2: Табела S1). Високото изразување на SERBP1 беше поврзано со лошо преживување кај пациентите со глиома во групите TCGA и CGGA (сл. S1A, дополнителна датотека 3: Табела S2). Освен тоа, забележавме дека SERBP1 покажува зголемени нивоа на изразување во 25 типови тумори во споредба со нормалното ткиво (Дополнителна датотека 1: Сл. S1B) и податоците во базата на податоци R2 покажаа дека високата експресија на SERBP1 е поврзана со лоша прогноза во случаите на невробластом , аденокарцином на панкреас, уротелен карцином на мочниот меур, цервикален сквамозен карцином и саркоми (Дополнителна датотека 1: Сл. S1C).

SERBP1 изразување и влијание врз преживувањето и терапијата на глиомот. а SERBP1 mRNA изразување во нормално човечко ткиво врз основа на базата на податоци GTEx. б Компаративна анализа на изразувањето на мРНК на SERBP1 во нормални примероци на мозок/кортекс (GTEx) и глиома (степени II, III и IV) од конзорциумот TCGA. в Имунобоење на репрезентативни примероци на глиома (степени II, III и IV) од групацијата на болницата во Шангај што ги покажува нивоата на изразување на протеинот SERBP1. г Кривите Каплан-Мајер укажуваат на преживување на 177 пациенти со глиома од групата на болницата во Шангај Чангџенг кои покажуваат ниски и високи нивоа на SERBP1. де Кривите Каплан-Мајер укажуваат на преживување на 118 GBM пациенти од групата на болницата во Шангај Чангџенг кои прикажуваат ниски и високи нивоа на SERBP1: E (сите пациенти), F (54 пациенти кои примиле ТМЗ) и G (83 пациенти кои примиле зрачење)

За да ги потврдиме и прошириме овие резултати, спроведовме студија користејќи група на глиома од болницата во Шангај Чангџенг. Примероците беа анализирани преку имунобоење SERBP1 не беше откриен во 21,5% од примероците, беше благо позитивен во 18,1%, беше умерено позитивен во 37,3% и беше силно позитивен кај 23,2% од пациентите. Понатаму испитавме дали експресијата на SERBP1 е поврзана со степените на глиом. SERBP1 беше позитивен кај 28,6% од оние со глиоми степен I, 55,6% од оние со глиоми степен II, 83,3% од оние со глиоми III степен и 89,0% од оние со глиоми степен IV (П < 0,001). Покрај тоа, 71,2% од пациентите со степен IV (GBM) имале високо позитивно боење за SERBP1, значително повеќе од степен I (7,1%), степен II (40,7%) и степен III (61,1%) глиоми (П < 0,001) (сл. 1в, дополнителна датотека 4: Табела S3). Експресијата на SERBP1 беше тесно поврзана со степенот на глиом на СЗО (низок степен наспроти висок степен, хи-квадрат тест, П = 0,002) (Дополнителна датотека 4: Табела S3). И покрај променливата експресија на SERBP1 кај глиомите, GBM примероците имаа значително поголема експресија на SERBP1 во споредба со примероците LGG. Средното преживување беше 13,12 ± 1,12 месеци (95% интервали на доверба [CI] 10,91-15,33) за пациенти со висока експресија на SERBP1 и 23,73 ± 1,76 (95% CI 20,23-27,23) месеци за пациенти со низок SERB1П < 0,0001) (сл. 1г). Пациентите со GBM со низок SERBP1 израз имале значително подолго преживување (17,41 ± 1,93 месеци, 95% CI 13,48-21,35) од оние со висок SERBP1 израз (10,52 ± 0,97 месеци, 95% CI 8,59-12,46)П = 0,0006) (сл. 1д).

Исто така, испитавме дали времето на преживување било под влијание на постоперативната адјувантна терапија (радиотерапија и хемотерапија). Како што е прикажано во (сл. 1f), меѓу пациентите со GBM кои примале хемотерапија (темозоломид), оние со ниски нивоа на SERBP1 имале значително подолго преживување (20,91 ± 2,52 месеци, 95% CI 15,67-26,15) од оние со високи нивоа на SERBP1 (11,11 ± 1,22 месеци, 95% CI 8,68-13,55) (П = 0,0002). Слично на тоа, пациентите со ниски нивоа на SERBP1 добија поголема корист од радиотерапијата во однос на преживувањето (18,81 ± 2,69 месеци, 95% CI 13,09-24,54) отколку оние со високи нивоа на SERBP1 (9,24 ± 1,15 месеци, 95% CI 6,57-1)П < 0,0001) (сл. 1g). Сите податоци за пациентот се наведени во (Дополнителна датотека 5: Табела S4).

SERBP1 влијае на фенотиповите релевантни за ракот

Спроведовме неколку анализи за да утврдиме дали е потребна висока експресија на SERBP1 за да се одржат фенотиповите релевантни за ракот. Сите експерименти беа изведени со нокаут на siRNA бидејќи обидите да се произведат нокаут линии SERBP1 користејќи го пристапот CRISPR-Cas9 не беа успешни, што сугерира дека барем линиите GBM што ги тестиравме не можат да опстанат без функцијата SERBP1.

Соборувањето на SERBP1 предизвика драматично влијание врз одржливоста на клетките U251 и U343 како што беше откриено преку анализата на MTS (сл. 2а, дополнителна датотека 1: Сл. S2A, S3A) Ние, исто така, спроведовме анализа за формирање на клеточни колонии и забележавме во двете линии дека намалувањето на SERBP1 изразувањето драматично ја намали способноста на GBM-клетката да формираат колонии (сл. 2б, дополнителна датотека 1: Сл. S3B). Слично на тоа, користејќи ја анализата на Boyden комората, утврдивме дека клеточната инвазија е компромитирана кога SERBP1 беше замолчен (сл. 2c, дополнителна датотека 1: Сл. S3C). Следно, испитавме дали нокдаунот на SERBP1 влијае на апоптозата. Го испитавме расцепувањето на PARP1 со Western blot, како и боење со анексин-V користејќи цитометрија на проток во двете сценарија, забележавме зголемување на производот во клетките трансфектирани со siSERBP1 во споредба со контролната siRNA (сл. 2d, e). Слично на тоа, забележавме поголема активност на каспаза 3/7 во SERBP1 соборувачките клетки во споредба со контролната, потврдувајќи ја улогата на SERBP1 во апоптозата (сл. 2f). Конечно, го оценивме влијанието на SERBP1 врз преживувањето и пролиферацијата на матичните клетки на глиом (GSC). Гелтрекс беше користен за да се дозволи GSC културите да растат како еднослојни. Преживувањето беше оценето со помош на анализата на МТС, додека пролиферацијата на клетките беше следена со текот на времето користејќи го системот Инкуцит. Соборувањето на SERBP1 го намали преживувањето и пролиферацијата на пронеуралните и мезенхималните ГСЦ (сл. 2g, h Дополнителна датотека 1: Сл. S2B).

SERBP1 влијае на фенотипите поврзани со ракот и растот на туморот. а Соборувањето на SERBP1 во U251 клетките ја намали одржливоста (MTS-анализа). б Замолчувањето на SERBP1 го намали клоногениот потенцијал, мерено со анализи за формирање колонии. в Анализата на Boyden комората беше искористена за да се процени влијанието на SERBP1 врз вредностите на инвазија на апсорпцијата на кристално виолетова боја покажа дека соборувањето на SERBP1 го намалува потенцијалот за инвазија. гѓ Замолчувањето на SERBP1 ја зголеми апоптозата како што е наведено со расцепувањето на PARP1 (г), боење со анексин (д), и каспаза (ѓ). е Пролиферацијата на GSC низ времето беше следена со автоматскиот систем Incucyte. Намалувањето на нивото на SERBP1 ја нарушува клеточната пролиферација. јас Соборувањето на SERBP1 во GSC линиите ја намали одржливоста (MTS анализи). Податоците беа анализирани со Студентски т тест и претставен како средна вредност ± стандардна девијација. Бонферони корекција беше искористена за повеќе споредби. *стр ≤ 0.05 **стр ≤ 0.01 ***стр ≤ 0.001 ****стр ≤ 0.0001. јас Интракранијалните ксенографти беа воспоставени со користење на клеточната линија shSERBP1 3565 GSC (10 глувци по група). Експерименталната група прими Dox за да предизвика изразување на shSERBP1. Кривите Каплан-Мајер укажуваат дека падот на SERBP1 го намалува растот на туморот и го проширил преживувањето. ј Репрезентативно боење Ki67 од границата на туморот за секоја група. Лента за скала = 100 μm

Следно, го оценивме влијанието на SERBP1 врз растот на туморот користејќи интракранијални ксенографти. Ја избравме многу агресивната GSC линија 3565 [22] и подготвивме стабилна линија која содржи тет-индуцирана SERBP1 shRNA преку лентивирусна инфекција. Евалуацијата на оваа линија ин витро покажа дека 80% нокдаун може да се постигне со третман со доксициклин. Намалување на формирањето и преживувањето на невросферата беа забележани по третманот со доксициклин и резултатите беа во корелација со количината на употребениот лек (Дополнителна датотека 1: Сл. S2C-F). И контролната група и експерименталните групи (5 мажи и 5 жени/група) беа имплантирани со 3565 SERBP1 shRNA-tet клетки. Во експерименталната група, клетките беа третирани со доксициклин пред имплантација и на глувците им беше дозволено да пијат вода што содржи доксициклин ad libitum. Со намалување на изразот SERBP1 во експерименталната група, го продолживме средното преживување за 11 дена наспроти контролната група (П = 0,0026) (сл. 2i). Туморите, исто така, покажаа многу различна морфологија. Како што се рефлектира со имунобоење со анти-Ki67, постои изразена разлика во бројот на високо пролиферирачки клетки (сл. 2j). Профилот на изразување на SERBP1, неговото влијание врз преживувањето на пациентите со GBM, одговорот на терапијата, фенотиповите на рак и растот на туморот го воспоставуваат SERBP1 како нов онкоген RBP во GBM.

Карактеризација на мотивот за врзување на SERBP1 и регулаторното влијание

За да ги дефинираме преференциите за врзување на РНК SERBP1, користевме RNAcompete [23]. Рекомбинантниот SERBP1 протеин со целосна должина беше инкубиран со базен од

240.000 дизајнирани (неслучајни) RNA олиго. РНК избрани од SERBP1 беа идентификувани преку хибридизација на микросреди и последователната пресметковна анализа идентификуваше мотив за врзување на РНК богат со GC за SERBP1 (сл. 3а). Ние, исто така, го изразивме и прочистивме SERBP1 како N-терминал His6 фузија протеин и користена флуоресцентна поларизација (FP) за квантитативно мерење на неговиот сврзувачки афинитет за РНК 7-мер (5'- GCGCGGG - 3'), идентификуван со RNAcompete. Измерената константа на дисоцијација на рамнотежа (КД) на интеракцијата SERBP1-RNA (КД

47 nM) го потврдува неговиот силен афинитет кон секвенцата идентификувана со RNA Compete (сл. 3б). За да утврдиме дали SERBP1 се врзува за овој мотив во клетките, спроведовме експеримент RIP-Seq. Го набљудувавме тоа

40% од видовите на mRNA, утврдени дека се врзани со SERBP1, го прикажуваат идентификуваниот мотив богат со GC во нивниот 3' UTR, број кој е многу поголем од очекуваниот случајно (сл. 3в). Целосните резултати од анализата RIP-Seq се прикажани во (Дополнителна датотека 6: Табела S5). Конечно, избравме гени со повеќе „мотиви за врзување на SERBP1“ во нивните 3' UTR, кои исто така беа погодени од соборувањето на SERBP1 (види RNA-Seq анализа подолу) за да се извршат анализи на луцифераза. Luc-reporters кои содржат 3' UTR на овие гени беа ко-трансфектирани со SERBP1 експресивен вектор или контрола. Во сите случаи, трансгенската експресија на SERBP1 ја зголеми експресијата на известувачот на луцифераза (сл. 3г), што укажува на промовирање на стабилноста на mRNA и/или транслација на овие транскрипти.

Мотив за врзување SERBP1. а Мотив за врзување на РНК SERBP1 добиен со RNACompete. б Анализата за поларизација на флуоресценцијата го покажува високиот афинитет на SERBP1 (КД

47 nM) до 7-мер РНК олигонуклеотид (5'- GCGCGGG - 3'). в

40% од транскриптите утврдени преку RIP-Seq како преференцијално поврзани со SERBP1 го прикажуваат идентификуваниот мотив богат со GC во нивниот 3′ UTR, бројка многу поголема од очекуваната случајно. г Резултатите од анализата на луцифераза покажуваат дека ко-трансфекцијата на вектор на експресија SERBP1 ја зголеми експресијата на конструкциите на известувачите кои содржат 3' UTR на гените кои прикажуваат наводни мотиви за врзување SERBP1. GAPDH беше користен како негативна контрола

SERBP1 е регулатор на „метаболизмот на ракот“

За да разбереме како SERBP1 придонесува за фенотипови релевантни за ракот, извршивме анализа на RNA-Seq во контролните наспроти SERBP1 соборувачките U251 клетки. Соборувањето на SERBP1 го намали изразувањето на голем сет на гени поврзани со метаболизмот и регулацијата на метаболизмот како што е илустрирано со врвните збогатени термини за генска онтологија (сл. 4а, дополнителна датотека 7: Табела S6). Анализата на мрежата покажа дека овој сет на гени поврзани со метаболизмот е многу меѓусебно поврзан (сл. 4б). Слично на тоа, RIP-Seq анализата утврди дека повеќе транскрипти (гени) врзани со SERBP1 се вмешани во метаболизмот (Дополнителна датотека 7: Табела S6). Конкретно, два меѓусебно поврзани метаболички патишта, биосинтезата на серин и циклусот со еден јаглерод (1C), се многу под влијание на соборувањето на SERBP1 (сл. 4в). Променетата експресија на гените поврзани со овие патишта беше потврдена со qRT-PCR и Western blot (сл. 4d, e). Имунобоење на ксенографтите, исто така, покажа дека нокдаунот на SERBP1, исто така, предизвика драматично намалување на експресијата на PHGDH кај туморите (сл. 4f).

SERBP1 го регулира метаболизмот. а Термини за збогатена генска онтологија (GO) поврзани со гени намалени на SERBP1 во U251 клетките. Сетот на гени беше анализиран со помош на Panther [24] и GO термините беа составени со користење на Revigo [25] наведени се најрепрезентативните термини поврзани со метаболизмот. б Мрежна анализа на гените вмешани во метаболизмот под влијание на соборувањето на SERBP1. Мрежата е изградена со помош на Стринг [26] земајќи ја предвид интеракцијата (експериментални докази), рударството на текст и истовремената појава. Различни бои беа користени за да се наведат кластери. в Шематски приказ на еден јаглероден циклус, прикажувајќи ги гените погодени од соборувањето на SERBP1. г, д qRT-PCR и Western blot анализата во U251 и U343 клетките го потврдија влијанието на SERBP1 врз експресијата на критичните гени вмешани во метаболизмот. ѓ Репрезентативно PHGDH имунобоење на тумори од студијата за ксенографт за секоја група. Лента за скала = 60 μm

Метаболизмот со еден јаглерод (1C) е универзален пат зависен од фолати кој произведува единици 1C кои се користат за de novo синтеза на пурин и тимидилат, интерконверзија на неколку амино киселини, производство на универзални метил донатори и регенерација на редокс кофактори, од кои сите имаат корист за ракот. преживување [27]. Таргетирањето на некои ензими 1C веќе е истражено како терапевтска стратегија [27,28,29]. Релевантните 1C гени вклучуваат PHGDH (3-фосфо-глицерат дехидрогеназа), SHMT2 (серин хидроксилметил-трансфераза 2), MTHFD2 (метилен тетрахидрофолат дехидрогеназа 2) и PSAT1 (фосфосерин аминотрансфераза 1) (сл. 4б). Во клетките на ракот, 3-фосфоглицератот се користи како дел од механизмот за поттикнување на растот за синтеза на серин и глицин и за генерирање на NADPH. Половина од јаглеродот добиен од гликоза се користи во биосинтезата на серин и PHGDH функционира како ограничувачки ензим во овој процес [30]. PHGDH е прекумерно изразен кај глиомот и влијае на инвазијата и ангиогенезата [31]. SHMT2 е критичен ензим во циклусот 1C [32] и ја контролира критичната точка во метаболизмот на ракот - насоката на конверзија на серин/глицин. Осиромашувањето на серинот ја инхибира пролиферацијата на клетките на ракот и ги намалува нивоата на пурините, сличен ефект е забележан по SHMT2 нокдаун [27]. MTHFD2 е ензим зависен од NAD+ со активност на дехидрогеназа и циклохидролаза вмешани во метаболизмот на фолатите во митохондрија 1C и тој е еден од најчесто метаболичките ензими преекспресирани кај туморите [33]. PSAT1 е критичен ензим во под-патот кој синтетизира L-серин од 3-фосфо-D-глицерат. Високата експресија на PSAT1 корелира со лоша прогноза кај многу тумори, вклучително и рак на дојка, колоректален, назофарингеален и езофагеален карцином и е поврзан со отпорност на лекови [34,35,36,37].

Спроведовме студија за метаболизам за да ги потврдиме резултатите од нашата RNA-Seq анализа. Бидејќи падот на siRNA на SERBP1 значително влијаеше на одржливоста и апоптозата, се одлучивме да користиме стабилна линија U251 со тет-индуцирана shRNA. Анализата на главна компонента (PCA) извршена на метаболомичните податоци покажува посебна поделба помеѓу контролната и SERBP1 соборувачките групи (Дополнителна датотека 1: Сл. S4A-B). Податоците за заплетот на вулканите покажуваат значително намалување на посредниците од метил циклусот (S-аденозилхомоцистеин и метионин) и акумулација на посредниците од 5-метилтиоаденозин (MTA) циклусот (путресцин и N-ацетилпутресцин) (Дополнителна датотека 1: Сл. S4C). Метаболичките анализи потврдија дека SERPB1 го модулира серинскиот метаболизам и го попречува трансферот на еднојаглеродна единица (C1) од циклусот на фолати во метил циклусот. Оваа промена може да ја промени метилацијата на ДНК/хистон, регенерацијата на редокс кофакторите и биосинтезата на нуклеотидите [27, 38, 39]. Ефектот е очигледен од значителното исцрпување на метионин и S-аденозилхомоцистеин (SAH), нуспроизвод на метилација што го рециклира метионин преку придонесот на метил група од метил-тетрахидрофолат (метил-THF) од 1C циклус (сл. 5а, в и дополнителна датотека 1: Сл. S4). Високите нивоа на метионин во клетката, како и диетите богати со метионин, се поврзани со прогресијата на туморот [40, 41]. Од друга страна, значајната нагорна регулација на прекурсорите на полиамин, путресцин и N-ацетил путресцин укажува на недостапност на метионин и неговиот метаболит S-аденозилметионин (SAM) SAM обезбедува амино-пропил група на путресцин за синтеза на полиамин преку MTA циклусот. 42]. Понатаму, осиромашувањето на цистеин е поврзано со надолната регулација на цистатионин-β-синтаза (CBS) која ја катализира биосинтезата на цистеин од SAH, со хомоцистеин и цистатионин како посредници [38].

Влијание на SERBP1 врз циклусите на еден јаглерод и метил и потенцијалните ефекти низводно. а Метаболичката анализа покажува дека замолчувањето на SERBP1 влијаело на производството на метаболити поврзани со циклусите на еден јаглерод, метил и МТА. б Интрацелуларно ниво на глутатион по замолчувањето на SERBP1. в Модел за влијанието на SERBP1 врз метаболизмот и функционалните низводно ефекти

Намалувањето на вкупните нивоа на глутатион беше одредено со анализа на луминисцентна основа (сл. 5б). Бидејќи цистеинот е претходник на глутатион (GSH), метаболит што го регулира редоксот, неговото трошење може да влијае на рамнотежата на редокс во SERPB1 нокдаун клетките (сл. 5в). Слично на тоа, значително намалување на коензимот Q10 (КоП10Х2) или висок CoQ10/CoQ10Х2 соодносот во групата со нокдаун сугерира дисрегулација на митохондријалниот респираторен синџир (mETC), инхибиција на оксидативната фосфорилација и генерирање на реактивни видови кислород (ROS) кои на крајот предизвикуваат апоптоза [43]. CoQ10 is a lipophilic redox cofactor that functions as an electron carrier in the mETC and generates the proton gradient that drives ATP synthesis through oxidative phosphorylation [44] (Fig. 5a, c). In summary, the results of the metabolic analysis support the changes observed in the genomic study, establishing SERBP1 as a novel regulator of metabolic pathways. Full results of the metabolic analysis are shown in (Additional File 8: Table S7).

SERBP1 impact on neuronal differentiation, “stemness,” and epigenetic regulation

Genes upregulated after SERBP1 knockdown are preferentially associated with nervous system development, neurogenesis, and synaptogenesis according to GO analysis (Fig. 6a, b Additional File 1: Fig. S5, Additional File 7: Table S6). This data suggests that SERBP1 could function as a “repressor” of neuronal differentiation. In fact, according to our previous analysis [46], most of these genes show an increase in expression during neurogenesis (Fig. 6c). SERBP1 shows the opposite pattern NSCs and GSCs display high levels of SERBP1 while decreased expression occurs when cells are induced to differentiate (Fig. 6d, Additional File 1: Fig. S6A-B). Next, we performed gene expression correlation analyses with R2 using TCGA GBM and brain samples. Genes showing strong negative correlation with SERBP1 are found in many GO-enriched categories previously identified in analyses of genes upregulated upon SERBP1 knockdown (e.g., synapse organization, nervous system development, and neurogenesis) (Additional File 9: Table S8, Additional File 10: Table S9). Overall, these results suggest that SERBP1 represses neuronal differentiation. We then evaluated whether increased SERBP1 expression can disrupt neuronal differentiation using the neuroblastoma BE-(2)-C cell line. Cells were infected with either SERBP1 expressing or control lentivirus and treated with or without retinoic acid (RA) to induce differentiation. After 4 days, we used an Incucyte system to measure neurite outgrowth as an indicator of differentiation. RA treatment effectively induced neurite formation but SERBP1 overexpression diminished the effect (Additional File 1: Fig. S6C-E).

SERBP1 knockdown increased expression of genes linked to neurogenesis and nervous system development. а Enriched Gene Ontology terms related to genes upregulated upon SERBP1 knockdown in U251 cells. Gene set was analyzed using Panther [24] and GO terms were compiled using [25]. Most representative terms associated with nervous system development and function are listed. б Network analysis of genes implicated in neuronal differentiation affected by SERBP1 knockdown. The network was built using String [26] considering interaction (experimental evidence), text mining, and co-occurrence. Different colors were used to indicate clusters. в Heatmap shows that genes upregulated upon SERBP1 knockdown cells display increased expression during murine neurogenesis—0 day/stem vs. 4 days/differentiated cells. г qRT-PCR shows SERBP1 and β-III Tubulin expression in neuronal stem cells (NSCs) and differentiated cells. д Genes upregulated upon SERBP1 knockdown showing decreased expression in GBM in reference to LGG are labeled in blue, genes that show reduced expression in GBM in reference to normal brain (cortex) are labeled in green and genes that are methylated (H3K27me3) in GBM cells [45] are labeled in orange. ѓ Western blot showing that SERBP1 knockdown leads to a decrease in H3K27me3 in GBM cells

The effect of SERBP1 on methionine production could ultimately influence histone and/or DNA methylation. Therefore, SERBP1 could function as an epigenetic modulator, indirectly repressing the expression of genes implicated in neuronal differentiation. Gene set enrichment analysis (GSEA) identified strong similarities between the list of upregulated genes in SERBP1 knockdown cells and binding profiles of H3K27me3 and EZH2 and SUZ12, two members of PRC2 which trimethylate histone H3 on lysine 27 (Additional File 11: Table S10). Analysis of H3K27me3 profiles in GBM cells [45] confirmed that several genes “repressed” by SERBP1 show H3K27me3 sites (Fig. 6e, Additional File 12: Table S11). Consistent with these results, levels of expression for most of these genes are decreased in GBM samples in comparison to brain (cortex) and LGG (Fig. 6e, Additional File 13: Table S12. Corroborating the association between SERBP1 and H3K27me3, we determined by Western analysis that SERBP1 knockdown in GBM cells reduced H3K27me3 levels (Fig. 6f).

We then tested if a reduction in SERBP1 levels could increase GBM cell sensitivity to PRC2 inhibition. EED226 is a potent and selective PRC2 inhibitor that directly binds to the H3K27me3 binding pocket of EED. Control and SERBP1 knockdown cells were treated with 20 or 40 μM of EED226 and cell proliferation was followed over time with an Incucyte. Since the impact of SERBP1 on cell proliferation is very strong, we decided to use a partial SERBP1 knockdown (40–50% reduction in proliferation) to appreciate the effect of combined treatment. While control cells showed almost no response to EED226 treatment, SERBP1 knockdown cells showed decreased proliferation in response to treatment (Additional File 1: Fig. S7A,S7C). To better illustrate the differences between siRNA control and SERBP1 knockdown cells, we show proliferation at the terminal time point, comparing EED226-treated cells to its respective untreated control (Additional File 1: Fig. S7B, S7D).

In line with these findings, we observed that SERBP1 knockdown decreased expression of several genes associated with PI3K/AKT signaling (Additional File 1: Fig. S8A, Additional File 7: Table S6) which has been shown to modulate the cancer epigenome through methylation [47]. Corroborating the connection between SERBP1 and the PI3K/AKT pathway, knockdown of SERBP1 reduced levels of AKT and p-AKT in U251 and U343 cells as observed by Western blot (Additional File 1: Fig. S8B). Finally, using the glioma cohort from the Shanghai Changzheng, we determined that AKT1 and SERBP1 display good expression correlation based on immunostaining (Additional File 1: Fig. S8C).

Finally, we examined whether increased expression of SERBP1 could contribute to stem cell features. We generated, via lentiviral infection, a U343 line that overexpresses SERBP1 (SERBP1 OE) (Additional File 1: Fig. S2G-H). Control (empty vector) and SERBP1 OE cells were grown as neuro-spheroids in stem cell media. SERBP1 OE cells were more efficient in forming spheres than controls and the difference increased in higher passages (Additional File 1: Fig. S9A-B). SERBP1 OE cells also showed increased expression of stem cell markers by qRT-PCR (Additional File 1: Fig. S9C). Increased metabolism and radio-resistance are characteristics of “cancer stem cells” [48]. We observed that SERBP1 OE cells also had increased mitochondrial respiration and ATP production compared to controls (Additional File 1: Fig. S9D-E). Consistent with the finding that that high SERBP1 expression influences response to radiation in GBM patients (Fig. 1G), SERBP1 OE cells were more resistant to radiation than controls as shown in a colony formation assay (Additional File 1: Fig. S9F).

Overall, our results indicate that SERBP1 contributes to GBM poorly differentiated state and glioma stem cell phenotypes by repressing genes implicated in neuronal differentiation and neuronal function. SERBP1 could influence epigenetic regulation by controlling methionine production via the one-carbon and methyl cycles and the AKT pathway.


Апстракт

Fatty acid, polyketide, and nonribosomal peptide biosynthetic enzymes perform structural modifications upon small molecules that remain tethered to a carrier protein. This manuscript details the design and analysis of cross-linking substrates that are selective for acyl carrier proteins and their cognate condensing enzymes. These inactivators are engineered through a covalent linkage to fatty acid acyl carrier protein преку post-translational modification to contain a reactive probe that traps the active site cysteine residue of ketosynthase domains. These proteomic tools are applied to Ешерихија коли fatty acid synthase enzymes, where KASI and KASII selectively cross-link ACP-bound epoxide and chloroacrylate moieties. These mechanism-based, protein–protein fusion reagents also demonstrated cross-linking of KASI to type II polyketide ACPs, while nonribosomal peptide carrier proteins showed no reactivity. Similar investigations into protein–protein interactions, proximity effects, and substrate specificities will be required to complete the mechanistic understanding of these pathways.


Дискусија

IL-1β is a pro-inflammatory cytokine involved in various liver diseases [6]. In this study we report that pre-treatment of hepatocytes with IL-1β enhances FasL-induced caspase-3/-7 activity, but astonishingly diminishes FasL-induced apoptosis. In the literature, contrary effects of IL-1β on cell viability are described. Ан in vivo study demonstrated that a pre-treatment of mice with IL-1β protected the animals from subsequent liver injury by Fas-dependent apoptosis. These mice showed decreased liver enzyme serum concentrations, reduced caspase-3/-7 activity levels and prolonged survival [3]. On the other hand, in pancreatic MIA PaCa-2 cells IL-1β mediated cell death by triggering the phosphorylation of JNK due to ER stress [30].

Our results demonstrate that treatment of hepatocytes with IL-1β alone resulted in a time-dependent phosphorylation of JNK1/2, which was previously described in mouse embryonic fibroblasts and in the rabbit liver [31], [32]. This JNK1/2 activation was essential for the crosstalk of IL-1β in the presence of FasL as its inhibition, but not that of p38 MAPK, abolished the increase in caspase-3/-7 activity that was mediated by IL-1β pre-treatment. JNK is known to be crucial for modulating the activity of pro-apoptotic BH3-only proteins. Ин витро и in vivo (thymus) studies showed that Bim and Bmf were phosphorylated by JNK in response to UV or during thymic selection [23]. Similarly, we recently reported that gliotoxin, a fungal toxin of Aspergillus fumigatus, induced apoptosis via JNK1/2-mediated phosphorylation of Bim at three sites (S100, T112 and S114) [24]. Bim phosphorylation by JNK1/2 was shown to increase its binding affinity to Bcl-2-like survival factors which translated into a better activation of Bax/Bak with subsequent cytochrome c release and caspase-3/-7 activation [23], [24]. In agreement with this, we could observe increased caspase-3/-7 levels after stimulation with IL-1β + FasL, and this response was abrogated in Bim -/- hepatocytes as well as in wt hepatocytes treated with the JNK inhibitor SP600125. In addition to Bim, we showed that Bid was crucial for the increased caspase-3/-7 activity. Bid -/- hepatocytes were unable to increase caspase-3/-7 activity upon IL1β + FasL treatment, thus preserving cell viability.

Our experimental observations are supported by a mathematical model, which was established to confirm that our network structure covers the observed effects in all scenarios and explains the underlying mechanism. The model indicates that the sensitizing is due to a depletion of free anti-apoptotic Bcl-2 proteins after tBid and Bim were formed and/or activated in response to IL-1β and FasL treatment. FasL contributes to apoptosis by cleaving full-length Bid into the pro-apoptotic tBid form, whereas IL-1β enhances the pro-apoptotic activity of Bim by JNK1/2-mediated phosphorylation (pBim). tBid and pBim bind to anti-apoptotic Bcl-2 proteins with high affinities. Hence, when cells are treated with FasL or IL-1β alone, either one of the BH3-only proteins is fully sequestered by Bcl-2 proteins. However, if both stimuli are present, the Bcl-2 protein buffer is insufficient to block tBid and pBim simultaneously leading to free amounts of the BH3-only proteins which can then directly activate Bax/Bak and trigger MOMP, cytochrome c release and increased caspase-3 activation. Thus, IL-1β sensitizes hepatocytes to FasL-induced caspase-3/-7 activation by shifting the balance from anti- to pro-apoptotic Bcl-2 proteins. The crucial role of Bid, Bim and JNK1/2 was further emphasized by simulating the knockout and inhibition scenarios. MOMP was ablated in both Bid -/- and Bim -/- knockout cells as well as in wt hepatocytes treated with the JNK inhibitor SP600125. While in Bid -/- cells, blockage of MOMP was because FasL could not trigger tBid formation, in Bim -/- cells and wt hepatocytes treated with SP600125 IL-1β was unable to favour MOMP via Bim phosphorylation. However, the question remained how IL-1β could increase FasL-induced caspase-3/-7 activation but at the same time attenuate FasL-induced cell death.

The threshold for MOMP-activation may significantly vary in individual cells within a population [33]–[35]. The intracellular ratio of pro- and anti-apoptotic Bcl-2 proteins determines the susceptibility of individual cells to apoptotic stimuli [36], [37]. Furthermore, Kallenberger et al. described heterogeneous caspase-8 activation in individual cells following FasL stimulation that critically depended on the quantity of FasL - Fas interaction and DISC formation [29]. We observed that only a fraction of hepatocytes died after 3 h of FasL treatment, whereas others appeared resistant to the stimulus. Our mathematical simulations showed that this heterogeneity may be explained by the dependence of caspase-3 activation and thus cell fate on different initial protein levels of Fas and Bcl-2. Accordingly, IL-1β pre-treatment favors MOMP-mediated apoptosis by influencing the Bcl-2 balance and thus promotes increased caspase-3 activity, but only in those cells which are susceptible to FasL-induced cell death anyway. Thereby, IL-1β pre-incubation leads to higher average caspase-3 levels but not to increased cell death. Our model predicts that pre-incubation with IL-1β changes the ratio of survivors, type I cells and type II cells. This could be verified by monitoring single cell responses to FasL and IL-1β + FasL stimulation distinguishing between type I and type II cells. So far the missing increase of PARP cleavage, the downstream event of caspase-3/-7 activation, supports our hypothesis.

We observed an enhancement of NF-㮫 DNA binding activity and induction of the NF-㮫 target gene A20 after treatment with IL-1β + FasL, whereas NF-㮫 DNA binding activity and A20 mRNA induction was reduced when IL-1β was substituted by TNFα ( Figs. 8 and ​ and9A). 9A ). Enhanced expression of A20 could be confirmed on the protein level ( Fig. 9 B-D ). This might explain increased cell viability of IL-1β + FasL treated hepatocytes. A20 is an inhibitor of caspase-8 activation and thereby can mediate a protective effect on FasL-induced apoptosis [28]. In our mathematical model, expression of the protective protein X that could be A20 can explain decreased caspase-3 activity in Bid -/- hepatocytes treated with IL-1β + FasL as well as increased cell viability in wt cells after treatment with IL-1β and FasL ( Fig. 13B ).

In addition to NF-㮫 activation and increased expression of A20 other survival signaling such as the PI3K/Akt pathway might be crucial for IL-1β-mediated protection. For example, active caspase-3 may trigger Akt activation and protection from apoptosis by proteolytic cleavage of RasGAP to a N-terminal fragment [38]. Furthermore, proteins that directly associate with active caspases and block their proteolytic activity such as the HGF-receptor domain, survivin or XIAP may suppress cell death induced by FasL [12], [39], [40]. Our results with XIAP - / - hepatocytes did not reveal any implication of XIAP in the IL-1β–mediated survival response. Whether Akt or other cellular caspase inhibitors are involved in the protective effect remains to be elucidated.

Altogether, we characterized the IL-1β-mediated sensitizing effect on FasL-induced caspase-3/-7 activation via comprehensive studies. Based on our experiments and according to our mathematical model it can be assumed that IL-1β exerts two distinct effects on FasL-induced apoptosis. On one hand it shifts the balance of Bcl-2 proteins to favoring MOMP and increasing the average caspase-3/-7 activity. On the other hand this pro-apoptotic effect is minimized by elevating A20 levels, which may reduce caspase-8 activation and further caspase-3 activation. Therefore, cells that show only a weak response to FasL stimulation and low caspase-8 levels could be rescued by a pre-incubation with IL-1β resulting in elevated cell viability. Moreover, we hypothesize that the seemingly contradictory results of increased caspase-3/-7 activity but decreased cell death do not represent the situation in a single cell but the average of a cell population.


THE EFFECTS OF PROTEIN BINDING ON THE PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF THE MEMBRANES

Proteins have a limited number of interaction partners and often display their functions through bimolecular interactions. However, biological membranes display physical properties that cannot be explained at the single-molecule level. For example, membranes display trans-bilayer coupling, phase behavior, and elasticity. The chemical composition of the bilayer affects its mechanical properties and, conversely, membranes adapt their compositions such that the physical properties are maintained when external conditions change (Janmey and Kinnunen, 2006). Peripheral membrane proteins can cause changes in the physicochemical properties of the membranes, such as alterations in membrane fluidity and phase behavior, and can induce formation of lipid microdomains.

Protein-induced lipid clustering can be studied by fluorescence spectroscopy using an acyl chain–labeled lipid molecule such as BODIPY-PI(4,5)P2 (Gambhir et al., 2004). This fluorescent probe has highly superimposable absorption and emission spectra and exhibits self-quenching properties when two or more molecules are brought into proximity. If protein binding induces the formation of PI(4,5)P2 microdomains, BODIPY-PI(4,5)P2 molecules are clustered together, resulting in intramolecular self-quenching (Figure 4). In addition to BODIPY-labeled lipids, pyrene-labeled phospholipids can be applied to study lipid microdomain formation upon protein binding (Pap et al., 1995 Kinnunen and Holopainen, 2000). It is important to note that fluorometric lipid-clustering assays are very sensitive to small environmental changes for example, divalent cations induce phosphoinositide clustering in model membranes (Wang et al., 2012). Thus such assays should always be carried out with proper controls and special attention should be paid to ensure no changes in the buffer conditions occur during the assay.

FIGURE 4: Detection of PI(4,5)P2 microdomain formation by a fluorometric assay using BODIPY-PI(4,5)P2.Interaction of a protein in a multivalent manner with specific lipids (e.g., PI(4,5)P2) may induce lipid clustering. Furthermore, oligomerization of membrane-binding proteins may induce clustering of specific lipid molecules. The BODIPY fluorescent probe has highly superimposable absorption and emission spectra and exhibits self-quenching properties when two or more molecules are brought into proximity. Upon lipid clustering, BODIPY-labeled lipids (e.g., PI(4,5)P2) form excimers, which results in intramolecular self-quenching of the BODIPY fluorescence. This change in BODIPY fluorescence can be applied for studying the effects of a protein on clustering of specific BODIPY-conjugated lipid species.

Other lipid probes, such as laurdan, prodan, and pyrene, are extensively used in studies concerning structural and dynamical properties of membranes (e.g., phase behavior, lipid order, membrane fusion). These probes can be incorporated into the lipid bilayer either alone or covalently linked to fatty acids. They locate at different depths in the bilayer and display distinct photophysical properties. Pyrene-labeled phospholipids are commonly used for studying lateral diffusion and segregation of lipids, as well as for membrane fusion assays (Kinnunen and Holopainen, 2000). Laurdan and prodan probes are sensitive to the physical state of the surrounding lipids, and are thus applied to study changes in lipid order and membrane-phase behavior (Parasassi et al., 1998 Krasnowska et al., 1998 Kaiser et al., 2009).


Методи

Sequence alignment and family tree construction

Amino acid sequence alignments and family tree construction were performed by Genstruct, Inc. (Cambridge, MA, USA). Amino acid sequences were obtained from annotated protein sequence files obtained from the NCBI reference proteins database, RefSeq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) or from Swiss-Prot (http://www.expasy.ch/sprot/) ( 14 ). Rigorous identification of family member sequences was accomplished using position-specific iterated basic local alignment search tool ( psi-blast ) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Multiple sequence alignments for each family group were generated using the clustalw 2 software (http://www.clustal.org). Visualization and manual editing of alignments were performed using GeneDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/). Interfamily sequence alignment was accomplished using a ‘sparse alignment’ approach [S. Smith (2009), personal communication] that aligns representative members of each family using clustalw 2 to define appropriate anchor points for the interfamily alignments. The final alignments were generated by manually adding additional proteins to the alignment, ensuring alignment of key anchor points identified in the sparse alignments. The final multiple sequence alignments used for the phylogenetic analysis are illustrated in the supplemental materials as Figures S1 and S2 for the PKMTs and the PRMTs (plus DOT1L), respectively.

The phylogenetic analysis of the aligned sequences was accomplished using the phylip package developed at the University of Washington (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html). To facilitate bootstrap analysis of the data, the seqboot program was used to create 250 randomized data representations of the input alignment for analysis. The protdist program was used to calculate pairwise distance measures between the sequences within the alignments using the blosum 45 matrix, and the program neighbor was used to construct phylogenetic trees from the distance data using the neighbor joining method. Consensus trees were built using the consense utility and uprooted trees were drawn using the drawtree program.

Determination of PMT enzymatic activity

Recombinant protein production and activity assays were performed for the 11 PMTs as described elsewhere ( 15 S. R. Daigle, E. J. Olhava, C. A. Therkelsen, C. R. Majer, C. J. Sneeringer, J. Song, D. Johnston, M. Porter Scott, J. J. Smith, Y. Xiao, L. Jin, K. W. Kuntz, R. Chesworth, M. P. Moyer, K. M. Bernt, S. A. Armstrong, R. A. Copeland, V. M. Richon, R. M. Pollock, unpublished data).

Determination of inhibitor IC50 вредности

ИЦ50 values for enzymes in the protein methyltransferase panel were determined under balanced assay conditions with both SAM and protein/peptide substrate present at concentrations equal to their respective КМ вредности. Where a peptide was used as methyl-accepting substrate, the peptide is referred to here by the histone and amino acid residue numbers that it represents. For example, peptide H3:16–30 refers to a peptide representing histone H3 amino acid residues 16 through 30. Flag and his-tagged CARM1 (2–585) purified from 293 cells was assayed at a final concentration of 0.25 n m against a biotinylated peptide corresponding to histone H3:16–30 (R26-Me1). E. coli-expressed EHMT2 (913–1193) was assayed at a final concentration of 0.1 n m against a biotinylated peptide corresponding to H3:1–15. Full-length EZH1 and EZH2 were expressed as four-component complexes in insect cells and purified as described elsewhere ( 15 ). EZH1 (4 n m ) and EZH2 (4 n m ) four-component complexes were assayed against a biotinylated peptide corresponding to histone H3:21–44. Insect expressed full-length PRMT1 was assayed at a final concentration of 0.75 n m against biotinylated peptide corresponding to H4:36–50. Flag-tagged full-length PRMT5 purified from 293 cells was assayed at a final concentration of 1.5 n m against a biotinylated peptide corresponding to H4:1–15. Ешерихија коли-expressed full-length PRMT8 was assayed at a final concentration of 1.5 n m against a biotinylated peptide corresponding to H4:31–45. Full-length SETD7 purified from Ешерихија коли was assayed at a final concentration of 1 n m against a biotinylated peptide corresponding to H3:1–15. Flag and his-tagged full-length WHSC1 was purified from 293 клетки and assayed at a final concentration of 2.5 n m against avian oligonucleosomes.

Determination of METTL11A enzymatic activity

Histone H3 and Histone H4 (NEB, Ipswich, MA, USA) were diluted separately in assay buffer (20 m m Tris, pH 8.0, 0.002% Tween20, 0.005% bovine skin gelatin, and 0.5 m m DTT) to a final concentration of 200 n m in a 96-well plate (25 μL each well). To monitor the reaction, 300 n m S-[methyl- 3 H]-adenosyl- l -methionine (80 Ci/mmol, from ARC) together with 200 n m cold SAM (total SAM concentration = 500 n m ) was used in each reaction. For initial determination of activity, METTL11A (Sino Biologics, Beijing, China) was added to initiate the reaction (25 μL each well for final concentration of 50 n m ). The reaction was incubated at room temperature and quenched with 10 μL per well of 300 μ m unlabeled S-adenosyl- l -methionine (Sigma, St. Louis, MO, USA) at various time-points. For detection, 50 μL of reaction was transferred to a filter plate [Millipore (Billerica, MA, USA) Multiscreen HTS FB 1.0/0.65 μm], washed three times with 10% trichloroacetic acid, washed once with 95% ethanol, and read on the Top Count (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) after the addition of 30 μL scintillant. Having established histone H4 as the preferred substrate, the enzyme concentration was titrated from 5 to 40 n m , and the reaction progress over time was determined at each enzyme concentration as described previously.

Structure determination of DOT1L with SAH or SAM bound

DOT1L-1-416 was produced in Ешерихија коли as either a GST or hexa-histidine N-terminal fusion protein. The GST-DOT1L-1-416 was cloned into the pGEX-KG vector and expressed in BL21 (DE3) cells (Novagen, Madison, WI, USA) with coexpression of chaperone plasmid pGTf2 (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) with 0.2 m m isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG), at 18 °C for 16 h. Cell pellets were suspended in buffer containing 50 m m Na2HPO4/NaH2ПО4, pH 7.5, 200 m m NaCl, 5% glycerol, and 5 m m β-mercaptoethanol. Cells were lysed by sonication. The supernatant was loaded onto a column of glutathione-sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare, Pittsburg, PA, USA). Protein was eluted with buffer containing 10 m m reduced glutathione. The GST-tag was cleaved from DOT1L-1-416 by thrombin and removed by a second run on a glutathione-sepharose column. The tag-free protein was purified further by SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) chromatography and eluted with 25 m m Tris–HCl, pH 8.0, 675 m m NaCl, 5% glycerol, and 5 m m β-mercaptoethanol. The protein was further purified by Superdex75 (GE Healthcare) chromatography in buffer containing 20 m m Tris–HCl, pH 8.0, 200 m m NaCl, 1 m m EDTA, and 1 m m dithiothreitol. Fractions of pure protein were pooled and concentrated to 40 mg/mL for crystallization work. The His-DOT1L-1-416 was cloned into pET30a vector with N-terminal His tag and expressed in BL21-Gold (DE3) (Stratagene, Cedar Creek, TX, USA). The culture was incubated at 37 °C until OD600 reached 0.3 and continued at 25 °C until OD600 reached 0.7. Expression was induced by adding 0.2 m m IPTG, and cells were harvested after 4 h. Cell pellet was suspended in buffer A (20 m m Tris–HCl, 500 m m NaCl, 10 m m imidazole, 10% glycerol, 5 m m β-mercaptoethanol, pH 7.8) with 1 mg/mL lysozyme and incubated on ice for 30 min. The cells were sonicated and centrifuged. The supernatant was loaded onto Ni-NTA column (Qiagen, Valencia, CA, USA) that preequilibrated with buffer A and washed with the same buffer. Protein was eluted with 200 m m imidazole in the buffer A and then dialyzed against 20 m m HEPES, 50 m m NaCl, 1 m m EDTA, 1 m m DTT, pH 7.5. The sample was loaded on a SP Sepharose Fast Flow column (GE Healthcare) and eluted with a linear gradient of 0–1 m NaCl. The target protein was concentrated and further purified by Superdex200 column (GE Healthcare) with 20 m m HEPES, 200 m m NaCl, 1 m m EDTA, 1 m m DTT, pH 7.8. Fractions of pure protein were pooled.

SAH or SAM (Sigma-Aldrich) was dissolved in the final DOT1L protein buffer to 100 m m . The DOT1L–SAH or DOT1L–SAM binary complex was prepared at a final concentration of DOT1L of 20 mg/mL (0.4 m m ) and SAH or SAM of 2 m m . Crystals were obtained in 1.94 m ammonium sulfate, 0.1 m sodium acetate, pH 5.3, and 2 m m TCEP by the hanging-drop method at 18 °C. The crystals were cryoprotected in 30% glucose and flash-frozen in liquid nitrogen. The diffraction data set for DOT1L–SAH was collected at beamline 17 U at Shanghai Synchrotron Radiation Facility and the data set for DOT1L–SAM was collected at beamline 21-ID-F at Advanced Photon Source in Argonne National Laboratory. All data were processed by HKL2000 ( 16 ). The SAH-bound crystal diffracted to 2.3 Å and the SAM-bound crystal diffracted to 2.1 Å, in the space group of P65 with one protein molecule in the asymmetric unit. The structures were solved by molecular replacement (Molrep) ( 17 ) using the published DOT1L–SAM structure (PDB ID: 1NW3) as a search model ( 18 ). Refinement was carried out by Refmac5 ( 19 ), and the model building was carried out by COOT ( 20 ). Detailed information on the diffraction data, refinement, and structure statistics is provided in Table S1.

The enzyme thus purified was tested for enzymatic activity in a radiometric assay of 3 H-CH3 transfer from labeled SAM (Perkin-Elmer) to purified nucleosomes from chicken erythrocytes according to the method of Fang et al. ( 21 ). The DOT1L used for crystallographic studies was found to have reproducible activity as a histone methyltransferase and displayed the following steady state kinetic parameters: кмачка = 0.3 per minute, = 0.67 μ m , = 8.6 n m , = 0.26 μ m . A more complete description of the enzymatic mechanism of DOT1L will be reported separately (A. Basavapathruni, C. R. Majer, R. A. Copeland and M. Porter Scott, manuscript in preparation).


Parallel single-cell analysis of active caspase-3/7 in apoptotic and non-apoptotic cells

Analysing the chemical content of individual cells has already been proven to reveal unique information on various biological processes. Single-cell analysis provides more accurate and reliable results for biology and medicine than analyses of extracts from cell populations, where a natural heterogeneity is averaged. To meet the requirements in the research of important biologically active molecules, such as caspases, we have developed a miniaturized device for simultaneous analyses of individual cells. A stainless steel body with a carousel holder enables high-sensitivity parallel detections in eight microvials. The holder is mounted in front of a photomultiplier tube with cooled photocathode working in photon counting mode. The detection of active caspase-3/7, central effector caspases in apoptosis, in single cells is based on the bioluminescence chemistry commercially available as Caspase-Glo ® 3/7 reagent developed by Promega. Individual cells were captured from a culture medium under microscope and transferred by micromanipulator into detection microvial filled with the reagent. As a result of testing, the limits of detection and quantification were determined to be 0.27/0.86 of active caspase-3/7 content in an average apoptotic cell and 0.46/2.92 for non-apoptotic cells. Application potential of this technology in laboratory diagnostics and related medical research is discussed.

Miniaturized device for simultaneous analyses of individual cells

Ова е преглед на содржината на претплата, пристап преку вашата институција.


Neurotransmitter Function Presynaptic Neurotransmission: Alterations in Exocytotic/Secretory Machinery and Glutamate Signaling in Kindling☆

Asymmetric Accumulation of SNARE Complexes (7SC)

We have examined the state of the SNARE proteins and several of the SNARE regulators in hippocampi from kindled animals. Initial studies showed an asymmetric accumulation of 7SCs in ipsilateral hippocampal synaptosomes prepared from animals kindled by entorhinal stimulation ( Matveeva et al., 2003 ). Control experiments suggest that this ispsilateral buildup of 7SCs is a marker of some basic biochemical change occurring during kindling and is indicative of epileptogenesis. Asymmetric accumulation cannot be induced by electroconvulsive shock nor is it seen in synaptosomes prepared from tissues outside of the limbic system, eg, cerebellum or occipital cortex. It can be induced by stimulating at several different sites including entorhinal cortex, septal region and amygdala it develops in the ipsilateral hippocampus regardless of whether the right or left hemisphere is stimulated ( Matveeva et al., 2007 ). As with kindling, asymmetric 7SC accumulation is not simply a shock burst response, but requires time to evolve and stimulation within a frequency range that promotes kindling. The accumulation occurs gradually during kindling, mirroring the progression of Racine behavioral stages ( Fig. 1 A), but it is persistent and can still be detected up to 1 year after attaining a minimally kindled state defined as two successive Stage 5 seizures ( Matveeva et al., 2008 ). It appears that a certain minimal level of kindling induction is necessary to induce permanence of the 7SCs asymmetry. In animals advancing up to but not beyond Stage 3, the asymmetry begins to develop. If they receive no further stimuli, by 1 month after the last stimulation hippocampal 7SCs symmetry is regained ( Fig. 1 B). Further, we have shown that kindling and 7SC asymmetric accumulation is associated with an increase in the amplitude of spontaneous glutamate release in the ipsilateral DG, a decrease in amplitude in the ipsilateral CA3, and no changes in signaling in the ipsilateral CA1 of the rat hippocampus ( Matveeva et al., 2012a ). Interestingly, the frequency of glutamate release in the ipsilateral DG is smaller than that seen in the ipsilateral CA1. Thus, kindling seems to alter glutamatergic signaling in multiple areas of the hippocampus and which change occurs is location specific (ie, an increase in release quanta versus an increase in the frequency of release events).

Слика 1. Asymmetric SNARE Complex (7SC) Accumulation Correlates with Kindling Stage. A) Animals were electrically kindled by amygdalar (open squares) or entorhinal cortical (closed squares) stimulation until they exhibited behavior consistent with the indicated Racine Stages. The next day, hippocampi were harvested from each animal and the ipsilateral/contralateral ratios of 7SCs were measured. One set of animals was fully kindled and hippocampi were harvest after 1 month (30 days). (B) Four cohorts of animals were held as naïve (no stimulation), kindled to Stage 2 by amygdalar (open bars), or kindled to Stage 4 by either amygdalar (hatched bars) or entorhinal cortical (solid bars) stimulation. Hippocampi were harvested from the animals either 1 day post stimulation or 1 month post stimulation and the ipsilateral/contralateral ratios of 7SCs were measured.

Once attained, the asymmetric accumulation of 7SCs is the most stable biochemical marker of kindling-induced epileptogenesis that we have been able to find in the literature ( Matveeva et al., 2008 ) It is not clear whether транс- или цис-7SCs accumulate. Ако се транс-7SCs, it represents an increase in engagement of the membrane fusion machinery and our observations might be consistent with a focal enhancement of NT release. Ако цис-7SCs accumulate, it might signal defective recycling machinery, although this would not be entirely consistent with the observed increases in NT release, particularly glutamate, measured in hippocampi from patients undergoing epilepsy surgery, in several reported seizure models, and the studies reported here.

At this stage of our investigations it is unclear whether the accumulation of 7SCs is merely an association or is part of a cause-effect relationship, either a driver of the kindled state or a sequela of the process. The control experiments described above demonstrate the tight correlation between kindling and asymmetric complex accumulation, but as discussed below, at least one anti-epilpetic drug can separate accumulation from kindling behavior. Further analysis with transgenic mice expressing reduced SNARE levels or defective SNARE regulation may prove to be a useful strategy to lower the availability of SNAREs and thus decrease the formation of 7SCs. Determining whether these conditions affect kindling progression might at least address whether complex accumulation is causative, responsive, or simply correlative. Either of the first two situations would indicate a locus for modification with agents useful to arrest epileptogenesis or quell epilepsy.


Погледнете го видеото: Proteini - ponavljanje (Август 2022).