Информации

Што е бакуловирус и како помага во истражувањето?

Што е бакуловирус и како помага во истражувањето?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Читав за биотехнологијата и употребата на инсекти и наидов на интересна статија за Техники за култура на клетки од инсекти, која конкретно зборуваше за употребата на бакуловирусот. Ако разбирам правилно, дали овој вирус помага да се изразат одредени гени кога се вметнува во клетка?

Извинете ако сум далеку или не користам соодветна терминологија, јас сум средношколец IB Биологија кој има уште многу да научи

Благодарам!


Бакуловирусите се класа на вируси кои инфицираат само прилично мал број на инсекти (или нивните клетки во клеточната култура). За да го стори тоа, вирусот треба да зарази клетка, да ја преземе за да произведе сопствени протеини и ДНК за да создаде нови вирусни честички и конечно да ги ослободи овие нови честички. Ова е во основа она што е прикажано на сликата подолу (од овде):

Од протеините кодирани од вирусниот геном, не се сите неопходни, што значи дека нивното отстранување нема да му наштети на вирусот или неговата функција. И ова се користи во Biotech за производство на протеини по избор. Еден од несуштинските протеини се заменува со секвенцата на протеинот што сакате да го произведат клетките. Потоа земате клетки од инсекти во клеточна култура (ова се клетки од единечни инсекти кои живеат во голем сад полн со медиум за култура), ги инфицирате овие клетки со модифицираниот вирус и на крајот го собирате протеинот од културата.

Предноста на бакуловирусите е тоа што тие ги инфицираат само клетките на инсектите на кои се специјализирани, така што тие се безбеден начин за производство на протеини за фармацевтски апликации. Ако сакате да прочитате нешто повеќе за ова, почнете овде.


Системи за изразување на бакуловирус

Spodoptera frugiperda (Sf9) клетките на инсектите се котрансфектираат со преносниот вектор (донатор или шатл) плазмидна ДНК што го содржи странскиот ген што треба да се изрази и BaculoGold™ ДНК (PharMingen), Bac-N-Blue™ ДНК (Invitrogen) или BacPAK6™ ДНК (Clontech ). Алтернативно, клетките на инсектите се трансфектираат со рекомбинантна бакмидна ДНК конструирана со транспозиција на донаторската плазмидна ДНК во Ешерихија коли клетки, таканаречениот метод Bac-to-Bac™ (Invitrogen-Gibco/Life Technologies). ДНК на бакуловирус е од Autographica californica вирус на нуклеарна полиедроза (AcNPV).

Методите BaculoGold™ и Bac-to-Bac™ се дизајнирани да постигнат практично 100% ефикасност на рекомбинација, а експресијата на рекомбинантниот протеин последователно се оценува со користење на рекомбинантен вирус засилен (без прочистување на плаката) во P2 во клетките на инсектите. Еднократно прочистување на плочата на рекомбинантниот вирус од иницијалното производство на вирусот (Р1 вирус) е опционално пред вирусот да се засили во втор премин (Р2) или повисок. Рекомбинантниот бакуловирус добиен од сите други комерцијално достапни бакуловирусни ДНК препарати се произведува со 80-90% ефикасност и бара прочистување на плаките за да се отстрани родителскиот вирус.


Содржина (25 поглавја)

Корисни совети, широко користени техники и квантифицирање на метаболичкото однесување на клетките

Вовед во бакуловирусната молекуларна биологија

Вектори за пренос на бакуловирус

Рекомбинантна изолација на бакуловирус

Изразување на гени во клетките на цицачите користејќи BacMam, модифициран бакуловирусен систем

Достапни клеточни линии од лепидоптерани инсекти

Изолација на клеточната линија на инсекти од лепидоптеран од ткивото на инсектите

Развој на медиуми без серум за клеточни линии од лепидоптерани инсекти

Рутинско одржување и складирање на клеточни линии од лепидоптерани инсекти и бакуловируси

Производство на протеини во мали размери со векторски систем за изразување на бакуловирус

Производство на рекомбинантен протеин во агитирани биореактори од големи размери со користење на векторски систем за изразување на бакуловирус

Производство на бакуловирус-експресирани рекомбинантни протеини во бранови биореактори

Производство на протеини со рекомбинантни бакуловируси во ларви од лепидоптерани

Производство на честички и вирусни вектори слични на вируси со користење на векторски систем за изразување на бакуловирусот/систем на клетки од инсекти

Трансформирање на клетки од инсекти од лепидоптер за континуирано изразување на рекомбинантен протеин

Трансформација на клеточните линии на Drosophila

Трансформирање на клетки од инсекти од лепидоптер за подобрена обработка на протеини

Вовед во употребата на бакуловирусите како биолошки инсектициди

Производство на бакуловирус инсектицид во ларви од инсекти

Евалуација на инсектицидната ефикасност на бакуловирусите од див и рекомбинантен тип

Следење и визуелизација на инфекција со бакуловирус со употреба на стратегија за зелен флуоресцентен протеин

Алтернативна стратегија за биореактор за испитување на инфекции и производство

Методи за замолчување на гените со RNAi

Користење на системот за клетки од бакуловирус/инсекти за проучување на апоптозата

Генерирање на бакуловируси модифицирани со обвивка за испорака на гени во клетките на цицачите


Нови алатки за изразување бакуловируси за производство на рекомбинантен протеински комплекс

Повеќето еукариотски протеини постојат како големи повеќекомпонентни склопови со многу подединици, кои дејствуваат заедно за да катализираат специфични клеточни активности. Многу од овие молекуларни машини се присутни само во мали количини во нивните домашни домаќини, што го попречува прочистувањето од изворниот материјал. Откривањето на нивната структура и функција при висока резолуција често зависи од хетерологната хиперпродукција. Рекомбинантното изразување на мултипротеинските комплекси за структурни студии може да повлече значителна, понекогаш инхибиторна, инвестиција и во труд и во материјали, особено ако менувањето и диверзификацијата на поединечните подединици се неопходни за успешно определување на структурата. Нашата лабораторија се справи со овој предизвик со развој на технологии кои го рационализираат сложениот процес на производство и диверзификација. Овде, прегледавме неколку од овие случувања за производство на рекомбинантен мултипротеински комплекс користејќи го системот за изразување на бакуловирус/клетка од инсекти MultiBac што го создадовме. Ние, исто така, се осврнавме на паралелизацијата и автоматизацијата на склопувањето на гените за изразување на мултипротеински комплекс преку развивање на роботски рутини за генерирање на повеќегенски вектори. Во овој придонес, ние се фокусираме на неколку подобрувања на перформансите на системот за експресивност на бакуловирусите што ги воведовме: модификациите на трансферните плазмиди, методите за генерирање на композитна мултигенска бакуловирусна ДНК и поедноставените и стандардизирани процедури на изразување кои ги разграничивме со користење на нашиот MultiBac систем.


Опаѓање на инсектите во антропоценот

Дејвид Л. Вагнер
Vol. 65, 2020 година

Апстракт

Во светот се пријавува пад на инсекти за летачките, копнените и водните лоза. Повеќето извештаи доаѓаат од западна и северна Европа, каде што фауната на инсектите е добро проучена и има значителни демографски податоци за многу таксономски различни. Прочитај повеќе

Слика 1: Локација на 73 извештаи за опаѓање на инсекти по таксон или група, адаптирана од Sánchez-Bayo & Wyckhuys (156). Секој квадрат претставува една студија, со основата на секоја наредена лента позиционирана над .

Слика 2: Трендови на популација за инсекти следени од Меѓународната унија за зачувување на природата (IUCN) и инсекти од ОК од Дирзо и сор. (34). (а) Податоци за трендот за Coleoptera (Col), Hym, на листата на IUCN.

Слика 3: Пресврт на среќата. Важен аспект на неодамнешните извештаи за опаѓање е доказ за нагло намалување на популацијата кај поранешните изобилни видови. (а) Скакулецот на Карпестите планини (Melanoplus spretus) -.


BacPAK метод

Системот BacPAK го користи бакуловирусот Autographa californica вирус на нуклеарна полиедроза (AcMNPV) за производство на целни протеини во клетките на инсектите. Целниот ген е вметнат во шатл-вектор, кој е котрансфектиран во клетки-домаќини на инсекти со линеаризираната вирусна ДНК на BacPAK6. Специјално дизајнираната BacPAK6 Viral DNA принудува рекомбинација помеѓу вирусот и преносниот вектор, што резултира со висока ефикасност на рекомбинација. По рекомбинацијата, неколку вирусни плаки се избираат и прочистуваат, а рекомбинантниот фенотип е потврден. Новоизолираниот рекомбинантен вирус потоа може да се засили и да се користи за инфицирање на клеточни култури од инсекти за да се произведе големи количини на саканиот протеин.

Доколку сакате, можете да го користите pBacPAK8-GUS (се продава како дел од BacPAK Baculovirus Expression System) како позитивна контрола за чекорот на котрансфекција. Овој преносен вектор има Ешерихија коли генот за бета-глукуронидаза (GUS) клониран низводно од неговиот полихедрински промотор. Рекомбинацијата на pBacPAK8-GUS со дигестот на ДНК BacPAK6 генерира рекомбинантни вируси кои изразуваат бета-глукуронидаза. Изразот на GUS може да се открие со генерирање на сина боја од хромогениот GUS супстрат X-GLUC.


ВОВЕД

Бакуловирусите се експлоатираат како експресивни вектори од 1983 година (1). Високо изразен, но непотребен вирусен ген многу доцна се заменува со ген од интерес за да се произведе рекомбинантен вирус кој изразува рекомбинантен протеин како дел од животниот циклус на вирусот (2). Бакуловирусите се робусни, безбедни и имаат добра евиденција на изразување на високо ниво, особено на сложени протеини [на пр. (3)]. Позадината на клетката на инсекти ги извршува повеќето пост-преведувачки модификации пронајдени во клетките на цицачите (4) и достапни се широк спектар на вектори и стратегии за клонирање (5). Овие квалитети предложија рекомбинантни бакуловируси како фаворизирана технологија за испорака на раствори за изразување на протеини со висока пропусност насочени кон покриеност на целиот геном (6), особено за високо обработените протеини чиј израз во Ешерихија коли е предизвик. Сепак, формирањето на рекомбинантниот вирус е значајно тесно грло во процесот. Рекомбинантното формирање често се врши преку генетска размена in vivo проследено со селекција врз основа на изменет фенотип (2), иако други системи како директно клонирање во вирусниот геном (7), рекомбинација во квасец (8) и транспозиција во Ешерихија коли (9) исто така се користени. Историски гледано, најдиректната технологија, рекомбинацијата во клетките на инсектите, отсекогаш водела до заднина на вирусот од див тип, покрај рекомбинантот и тоа барало повеќе чекори за изолација на вирусот за да се избегне евентуално израснување од дивиот тип. Ова е делумно заобиколено со употреба на линеаризирана вирусна ДНК која не може да иницира вирусна инфекција освен ако не е спасена од настанот на рекомбинација (10). Сепак, дури и со употреба на линеарна ДНК, позадинскиот вирус е можност и се советуваат анализи на плакета за да се обезбеди 100% рекомбинантна. Очигледно, ако рекомбинантните бакуловируси треба да бидат клучна технологија во генерирањето на многу илјадници рекомбинанти, треба да се избегне генерирањето на позадински вирус, колку и да е со мала фреквенција.

Овде, користејќи рекомбинациска методологија за клонирање која користи RecE и RecT генски производи, „ET клонирање“ (11), опишуваме нокаут на вирусен ген што го прави вирусот не-одржлив освен ако не се спаси со рекомбинантна формација. Протоколите за рекомбинација се и скратени и направени 100% ефикасни со оваа модификација што овозможува вистинско формирање на рекомбинантна „одење“ и намерно вклучување на масовна експресија на бакуловирус во стратегии за изразување на протеини со висока пропусна моќ.


Системска платформа за вектор за изразување на бакуловирус за производство на адено-асоцирани вируси

Адено-асоцираните вируси (AAV) станаа релевантни за in vivo генска терапија (Nayerossadat et al., 2012, Flotte, 2013, Wang и Gao, 2014). Оваа терапија вклучува инкорпорирање на гени во клетките. AAV што се користи како вирусен вектор е алатка која овозможува безбедно, ефикасно и специфично инкорпорирање на генот во организмот. Првата група на наследни болести за кои беше испитувана генската терапија вклучуваше хемофилија А и Б, макуларна дегенерација на Лебер и мускулна дистрофија на Душен, но во денешно време има многу студии фокусирани на болести на централниот нервен систем, како што се Паркинсоновата и Д. различни видови на рак, кардиоваскуларни маки и регенерација на коските (Flotte et al., 1996, Kay et al., 2000, Kaplitt et al., 2007, Jiang et al., 2011). Проценка од 70%�% од човечката популација била изложена на барем еден настан на инфекција со ААВ, и не се поврзани никакви негативни последици со инфекцијата и латентноста на овие вируси (Boutin et al., 2010, Erles et al. al., 1999, Tobiasch et al., 1998). ААВ имаат едноверижен ДНК геном и се вируси без обвивка со дијаметар од 18� nm. Тие припаѓаат на семејството Парвовирус и се класифицирани како членови на Депендовирус родот. Изолирани се 20 човечки и нечовечки соеви на примати, и сите серотипови освен серотипот 5 имаат многу слична структура на капсидите, големината на геномот и организацијата. AAV геномот има големина од приближно 4,7 kb и содржи два ORF кои кодираат четири регулаторни протеини. Овие ORF се опкружени со две инвертирани терминални повторувања (ITR) кои содржат cis-регулаторни секвенци потребни за вирусна инфекција. Главните протеини Rep78 и Rep68 се вклучени во ексцизија, спасување, репликација и интеграција на геномот. Интеграцијата во геномот на домаќинот е специфична за локацијата и се одвива во хромозомот 19, поконкретно во локус AAVS1 на човечкиот геном, без негативни последици. Малите протеини Rep52 и Rep40 се одговорни за акумулацијата на ДНК и пакувањето. VP1, VP2 и VP3 се структурни протеини кодирани во Cap ORF.

Рекомбинантните AAV се конструирани со замена на претставник и капа гени со гои опкружени со ITR региони. Овој вирусен вектор е способен да трансдуцира и активна поделба и клетки кои мируваат. Многу е важно да се нагласи дека, за разлика од wt AAV, рекомбинантниот AAV нема капацитет за интеграција специфичен за локацијата бидејќи претставник гените се отсутни, така што интеграцијата се случува по случаен избор. Сепак, проценетата фреквенција на интеграција на овие рекомбинантни адено-асоцирани вируси (rAAVs) е 0,1%𠄰,5% во клеточните линии на цицачи (McCarty et al., 2004). Со оглед на ова, за да се воспостави стабилна и упорна експресија кај пациентите, развиена е алтернатива на интеграцијата на геномот која се состои во двоверижна ДНК која опстојува како епизома во внатрешноста на клетките (Јанг и сор., 1999). Досега, адено-асоцираните вектори се модифицирани за да бидат специфични за ткивото, а најпосакуваните органи се оние кои се привилегирани од имунитет, како што се окото или мозокот.

Класичната техника за производство на ААВ вклучува HEK293, A549 или HeLa клетки котрансфектирани со два плазмида, од кои едниот содржи рекомбинантна ДНК (рекомбинантна адено-асоцирана вирусна плазмида), а другата претставник и капа гени (pHelper). Клетките потоа се инфицирани со помошен вирус како што е аденовирус или вирус на херпес симплекс за да се овозможи репликација на рекомбинантниот AAV (Samulski et al., 1987). Лошата страна на оваа методологија е можноста за несакани настани на рекомбинација помеѓу плазмидите и дека прочистувањето на помошниот вирус одзема многу време, а процесот на зголемување е тешко да се постигне. Добра алтернатива беше употребата на платформата BEVS [ревидирана во Галиберт и Мертен (2011) ], која вклучува употреба на три рекомбинантни бакуловируси и Sf9 клетки. Секој од трите рекомбинантни бакуловируси содржи еден од следниве гени: претставник, капа, и конструкција од интерес опкружена со ИТР. Алтернативи кои вклучуваат полицистронски бакуловирус кој содржи претставник и капа се користат и гени (Smith et al., 2009). Системот OneBac вклучува трансгенски клеточни линии на инсекти кои ги изразуваат гените претставник и капа на AAV и само еден рекомбинантен бакуловирус. Ефикасноста на оваа техника и изводливоста за зголемување се повисоки од претходните алтернативи и обезбедува пофлексибилна стратегија бидејќи овозможува производство на други AAV серотипови со едноставно менување на клеточните линии (Mietzsch, 2014). Како што се другите производи добиени од BEVS, контаминацијата на rAAV со честички од бакуловирус треба да се намали. Веќе постои еден rAAV произведен од BEVS на пазарот комерцијализиран како Glybera (alipogene tiparvovec) развиен и продаден од uniQure кој го компензира недостатокот на липопротеинска липаза, кој доби регулаторно одобрение од Европската агенција за лекови во 2012 година, иако сега е прекинат поради недостаток на побарувачка.


Што е бакуловирусот и како помага во истражувањето? - Биологија

Сите написи објавени од MDPI се веднаш достапни ширум светот под лиценца за отворен пристап. Не е потребна посебна дозвола за повторна употреба на цела или дел од статијата објавена од MDPI, вклучувајќи слики и табели. За статии објавени под лиценца за отворен пристап Creative Common CC BY, кој било дел од статијата може да се користи повторно без дозвола, под услов оригиналната статија да е јасно цитирана.

Карактеристичните трудови претставуваат најнапредно истражување со значителен потенцијал за големо влијание на теренот. Карактеристичните трудови се поднесуваат по индивидуална покана или препорака од научните уредници и се подложуваат на рецензија пред објавувањето.

Карактеристичниот труд може да биде или оригинална истражувачка статија, значителна нова истражувачка студија која често вклучува неколку техники или пристапи, или сеопфатен прегледен труд со концизни и прецизни ажурирања за најновиот напредок во областа што систематски ги прегледува највозбудливите достигнувања во научниот литература. Овој тип на хартија дава поглед на идните насоки на истражување или можни апликации.

Статиите на Editor’s Choice се засноваат на препораките на научните уредници на списанијата MDPI од целиот свет. Уредниците избираат мал број написи неодамна објавени во списанието за кои веруваат дека ќе бидат особено интересни за авторите или важни во оваа област. Целта е да се обезбеди слика на некои од највозбудливите дела објавени во различни истражувачки области на списанието.


Сеопфатен водич за комерцијални векторски системи за изразување бакуловируси за производство на рекомбинантен протеин

Автор(и): Вибхор Мишра* Медицинскиот институт Хауард Хјуз и Одделот за биологија, Универзитетот во Индијана, Блумингтон, IN 47405, Соединетите Американски Држави

Припадност:

Име на весник: Букви од протеини и пептиди

Том 27, број 6, 2020 година




Графички апстракт:

Апстракт:

Системот за вектор на изразување на бакуловирусот (BEVS) е работна сила за изразување на рекомбинантен протеин повеќе од триесет и пет години. Уште кога првпат беше употребен за прекумерно изразување на човечкиот протеин IFN-β, системот беше конструиран и модифициран неколку пати за брзо и лесно изразување и зголемување на рекомбинантните протеини. Повеќекратните генски склопови извршени на геномот на бакуловирусот со употреба на методи на синтетичка биологија доведуваат до оптимизирана прекумерна експресија на мултипротеинските комплекси. Во денешно време, неколку комерцијално достапни платформи BEVS нудат различни приспособливи функции и честопати е збунувачки која да избере за почетник корисник. Овој краток преглед е наменет да биде водич за едно место за комерцијално достапната технологија на бакуловирус за хетерологна протеинска експресија во клетките на инсектите, на која корисниците можат да се повикаат да изберат од популарните и посакуваните производи или услуги на BEVS.

Букви од протеини и пептиди

Наслов:Сеопфатен водич за комерцијални векторски системи за изразување бакуловируси за рекомбинантно производство на протеини

ВОЛУМЕН: 27 ПРОБЛЕМ: 6

Автор(и):Вибхор Мишра*

Припадност:Медицинскиот институт Хауард Хјуз и Одделот за биологија, Универзитетот во Индијана, Блумингтон, IN 47405

Апстракт:Системот за вектор на изразување на бакуловирусот (BEVS) е активна работа за изразување на рекомбинантен протеин повеќе од триесет и пет години. Уште кога првпат беше искористен за прекумерно изразување на човечкиот протеин IFN-β, системот беше конструиран и модифициран неколку пати за брзо и лесно изразување и зголемување на рекомбинантните протеини. Повеќекратните генски склопови извршени на геномот на бакуловирусот со употреба на методи на синтетичка биологија доведуваат до оптимизирана прекумерна експресија на мултипротеинските комплекси. Во денешно време, неколку комерцијално достапни платформи BEVS нудат различни приспособливи функции и честопати е збунувачки која да избере за почетник корисник. Овој краток преглед е наменет да биде водич за едно место за комерцијално достапната технологија на бакуловирус за хетерологна протеинска експресија во клетките на инсектите, на која корисниците можат да се повикаат да изберат од популарните и посакуваните производи или услуги на BEVS.


Погледнете го видеото: Безумный Фильм 2020 Ужасы, триллер зомби вирус 720 X 1280 (Август 2022).