Информации

5А: Вовед во реверзибилно врзување - биологија

5А: Вовед во реверзибилно врзување - биологија


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Цели на учење

  • напишете равенки за константата на дисоцијација (KD), маса рамнотежа на вкупната макромолекула (M0), вкупниот лиганд (L0) и [ML] како функција од L или Lo ([ML] = [M0][L]/(KD+ [L]) (кога Lo >> Mo или кога е познато слободното [L]) и Y = фракциона заситеност = Y = ([ML]/[M0] = [L]/(KD+ [L])
  • одлучете која од двете дадени равенки за [ML] треба да се користи под услови кога се дадени горенаведените услови за L0 и L
  • врз основа на равенката ([ML] = [M0][L]/(KD+ [L]) нацртајте квалитативни графикони за различни дадени L0, L и Kd вредности
  • да се определи заситеноста на дропот дадени релативни вредности на Kd и L, под претпоставка дека L0 >> M0
  • спореди релативна % врзана за ковалентно врзување на протони со киселина и нековалентно врзување на лиганд со макромолекула дадени pka/pH и Kd/L вредности
  • опишете ги разликите во кривите на врзување за врзување на лиганд со макромолекула и димеризација на макромолекула
  • изведе равенка која ги покажува односите помеѓу константата на брзина за врзување (kon), дисоцијација (koff) и термодинамичката дисоцијација (Kd) или константа на рамнотежа (Keq).
  • опишете ги структурните и математичките разлики помеѓу специфичното и неспецифичното врзување
  • со оглед на Kd, проценете ги вредностите t1/2 за животниот век на комплексот ML.
  • опишете ги техниките што се користат за одредување на ML за дадени L или L0 вредности, вклучувајќи ги и оние кои бараат и не бараат одвојување на ML од M, така што вредностите на Kd за интеракција M и L може да се одредат
  • Наведете ги предностите на изотермалната титрација на калориметрија и површинската плазмонска резонанца во одредувањето на параметрите на сврзувачката интеракција

Cis-регулаторен елемент

Cis-регулаторни елементи (CREs) или Cis-регулаторни модули (CRM-и) се региони на некодирачка ДНК кои ја регулираат транскрипцијата на соседните гени. CRE се витални компоненти на генетските регулаторни мрежи, кои пак ја контролираат морфогенезата, развојот на анатомијата и другите аспекти на ембрионалниот развој, проучувани во еволутивната развојна биологија.

CRE се наоѓаат во близина на гените што тие ги регулираат. CRE обично ја регулираат генската транскрипција со врзување за факторите на транскрипција. Еден фактор на транскрипција може да се поврзе со многу CRE и оттука да ја контролира експресијата на многу гени (плеиотропија). Латинскиот префикс цис значи „од оваа страна“, т.е. на истата молекула на ДНК како и генот(ите) што треба да се транскрибира.

CRM-и се делови од ДНК, обично со должина од 100-1000 базни парови на ДНК, [1] каде што голем број фактори на транскрипција можат да го врзат и регулираат изразот на блиските гени и да ги регулираат нивните стапки на транскрипција. Тие се означени како цис бидејќи тие се типично лоцирани на истата нишка на ДНК како и гените што ги контролираат за разлика од нив транс, што се однесува на ефекти врз гените кои не се наоѓаат на истата нишка или подалеку, како што се факторите на транскрипција. [1] Еден цис-регулаторниот елемент може да регулира неколку гени, [2] и обратно, еден ген може да има неколку цис-регулаторни модули. [3] Cis-регулаторните модули ја извршуваат својата функција со интегрирање на активните фактори на транскрипција и поврзаните ко-фактори во одредено време и место во ќелијата каде што се чита оваа информација и се дава излез. [4]

CRE се често, но не секогаш спротиводно од местото на транскрипција. CRE е во контраст со транс-регулаторните елементи (TREs). TRES код за факторите на транскрипција. [ потребен е цитат ]


Содржини

Врзувањето на лигандот за врзивно место на протеинот често предизвикува промена во конформацијата на протеинот и резултира со изменета клеточна функција. Оттука, местото на врзување на протеинот се критични делови на патеките за трансдукција на сигналот. [10] Видови лиганди вклучуваат невротрансмитери, токсини, невропептиди и стероидни хормони. [11] Местата за врзување предизвикуваат функционални промени во голем број контексти, вклучувајќи ја ензимската катализа, сигнализацијата на молекуларната патека, хомеостатската регулација и физиолошката функција. Електричниот полнеж, стеричната форма и геометријата на локацијата селективно овозможуваат врзување на високо специфични лиганди, активирајќи одредена каскада на клеточни интеракции за кои е одговорен протеинот. [12] [13]

Уредување на катализа

Ензимите предизвикуваат катализа со посилно врзување за преодните состојби отколку супстратите и производите. На местото на каталитичко врзување, неколку различни интеракции може да делуваат на подлогата. Тие се движат од електрична катализа, киселинска и базна катализа, ковалентна катализа и катализа на метални јони. [11] Овие интеракции ја намалуваат енергијата на активирање на хемиската реакција преку обезбедување поволни интеракции за стабилизирање на молекулата со висока енергија. Ензимското врзување овозможува поблиска близина и исклучување на супстанции ирелевантни за реакцијата. Несаканите реакции исто така се обесхрабрени од ова специфично врзување. [14] [11]

Видови на ензими кои можат да ги извршуваат овие дејства вклучуваат оксидоредуктази, трансферази, хидролази, лиази, изомерази и лигази. [15]

На пример, трансферазата хексокиназа ја катализира фосфорилацијата на гликозата за да создаде гликоза-6-фосфат. Остатоците од активното место на хексокиназа овозможуваат стабилизирање на молекулата на гликоза во активното место и го поттикнуваат почетокот на алтернативен пат на поволни интеракции, намалувајќи ја енергијата на активирање. [16]

Инхибиција Уреди

Инхибицијата на протеини со врзување на инхибиторот може да предизвика опструкција во регулацијата на патеката, хомеостатската регулација и физиолошката функција.

Конкурентните инхибитори се натпреваруваат со супстратот за да се врзат за слободните ензими на активните места и на тој начин го попречуваат производството на комплексот ензим-супстрат при врзувањето. На пример, труењето со јаглерод моноксид е предизвикано од конкурентното врзување на јаглерод моноксид за разлика од кислородот во хемоглобинот.

Алтернативно, неконкурентните инхибитори се врзуваат истовремено со супстратот на активни места. По врзување за комплекс на ензимски супстрат (ES), се формира комплекс на инхибитор на ензимска супстрат (ESI). Слично на конкурентните инхибитори, стапката на формирање на производот е исто така намалена. [5]

И на крај, мешаните инхибитори се способни да се врзат и за слободниот ензим и за комплексот ензим-супстрат. Меѓутоа, за разлика од конкурентните и неконкурентните инхибитори, мешаните инхибитори се врзуваат за алостеричното место. Алостеричното врзување индуцира конформациски промени кои може да го зголемат афинитетот на протеинот за супстратот. Овој феномен се нарекува позитивна модулација. Спротивно на тоа, алостеричното врзување кое го намалува афинитетот на протеинот за супстратот е негативна модулација. [17]

Активен сајт Уреди

На активното место, супстратот се врзува за ензим за да предизвика хемиска реакција. [18] [19] Супстратите, преодните состојби и производите може да се врзат за активното место, како и за сите конкурентни инхибитори. [18] На пример, во контекст на протеинската функција, врзувањето на калциумот со тропонин во мускулните клетки може да предизвика конформациска промена на тропонин. Ова му овозможува на тропомиозин да го изложи местото на врзување на актин-миозин за кое се врзува главата на миозин за да формира вкрстен мост и да предизвика мускулна контракција. [20]

Во контекст на крвта, пример за конкурентно врзување е јаглерод моноксид кој се натпреварува со кислородот за активното место на хем. Високиот афинитет на јаглерод моноксид може да го надмине кислородот во присуство на ниска концентрација на кислород. Во овие околности, врзувањето на јаглерод моноксид предизвикува промена на конформацијата што го обесхрабрува хемот да се врзе за кислород, што резултира со труење со јаглерод моноксид. [5]

Алостерична локација Уреди

На регулаторното место, врзувањето на лиганд може да предизвика засилена или инхибирана протеинска функција. [5] [21] Врзувањето на лиганд за алостерична локација на мултимерен ензим често предизвикува позитивна соработка, односно врзувањето на еден супстрат предизвикува поволна промена на конформацијата и ја зголемува веројатноста ензимот да се врзе за втор супстрат. [22] Лигандите на регулаторната локација може да вклучуваат хомотропни и хетеротропни лиганди, во кои еден или повеќе типови на молекули влијаат соодветно на ензимската активност. [23]

Ензимите кои се високо регулирани често се неопходни во метаболичките патишта. На пример, фосфофруктокиназата (PFK), која ја фосфорилира фруктозата во гликолизата, во голема мера е регулирана со АТП. Нејзината регулација во гликолизата е императив бидејќи тоа е чекорот на посветување и ограничување на брзината на патеката. PFK, исто така, ја контролира количината на гликоза назначена за формирање на АТП преку катаболичкиот пат. Затоа, на доволно нивоа на АТП, ПФК е алостерично инхибиран од АТП. Оваа регулатива ефикасно ги зачувува резервите на гликоза, кои може да бидат потребни за други патишта. Цитрат, посредник од циклусот на лимонска киселина, исто така работи како алостеричен регулатор на PFK. [23] [24]

Места за врзување со еден и повеќе синџир Уреди

Местата за врзување може да се карактеризираат и со нивните структурни карактеристики. Местата со еден синџир (на „монодемични“ лиганди, μόνος: единечни, δεσμός: врзување) се формираат од еден протеински синџир, додека местата со повеќе синџири (на „полидемични“ лиганди, πολοί: многу) [25] се чести кај протеините комплекси и се формираат од лиганди кои врзуваат повеќе од еден протеински синџир, обично во или во близина на протеинските интерфејси. Неодамнешните истражувања покажуваат дека структурата на местото на врзување има длабоки последици за биологијата на протеинските комплекси (еволуција на функцијата, алостерија). [26] 27]

Криптични обврзувачки локации Уреди

Криптичните места за врзување се местата за врзување кои се минливи формирани во форма на апо или кои се индуцирани со врзување на лигандот. Разгледувањето на криптичните места за врзување ја зголемува големината на потенцијалниот човечки протеом што може да се дрогира од

78% од протеините поврзани со болеста. [28] Местата за врзување се истражени од: машина за вектор за поддршка применета на множество податоци „CryptoSite“, [28] Проширување на множеството податоци „CryptoSite“, [29] симулација на молекуларна динамика со долг временски период со модел на состојбата на Марков и со биофизички експерименти, [30] и индекс на криптична локација што се базира на релативната достапна површина. [31]

Кривите на врзување го опишуваат врзувачкото однесување на лигандот со протеинот. Кривите може да се карактеризираат со нивната форма, сигмоидна или хиперболична, што одразува дали протеинот покажува кооперативно или некооперативно врзувачко однесување, соодветно. [32] Вообичаено, x-оската ја опишува концентрацијата на лигандот, а y-оската ја опишува фракционата заситеност на лигандите врзани за сите достапни места за врзување. [5] Равенката Michaelis Menten обично се користи при определување на обликот на кривата. Равенката Michaelis Menten е изведена врз основа на услови на стабилна состојба и ги отсликува ензимските реакции што се случуваат во растворот. Меѓутоа, кога реакцијата се одвива додека ензимот е врзан за супстрат, кинетиката се одвива поинаку. [33]

Моделирањето со врзувачки криви се корисни при евалуација на врзувачките афинитети на кислородот со хемоглобинот и миоглобинот во крвта. Хемоглобинот, кој има четири хем групи, покажува кооперативно врзување. Ова значи дека врзувањето на кислородот со хем групата на хемоглобинот предизвикува поволна промена на конформацијата што овозможува зголемена поволност за врзување на кислородот за следните хем групи. Во овие околности, врзувачката крива на хемоглобинот ќе биде сигмоидна поради неговата зголемена поволност за врзување за кислород. Бидејќи миоглобинот има само една хем група, тој покажува некооперативно врзување кое е хиперболично на врзувачката крива. [34]

Биохемиските разлики помеѓу различните организми и луѓето се корисни за развој на лекови. На пример, пеницилинот ги убива бактериските ензими со инхибиција на ДД-транспептидазата, уништувајќи го развојот на бактерискиот клеточен ѕид и поттикнувајќи клеточна смрт. Така, проучувањето на местата за врзување е релевантно за многу полиња на истражување, вклучувајќи механизми за рак, [35] формулација на лекови, [36] и физиолошка регулација. [37] Формулирањето на инхибитор за исклучување на функцијата на протеинот е вообичаена форма на фармацевтска терапија. [38]

Во опсегот на ракот, лигандите кои се уредени да имаат сличен изглед на природниот лиганд се користат за да го инхибираат растот на туморот. На пример, метотрексат, хемотерапевтски лек, делува како конкурентен инхибитор на активното место на дихидрофолат редуктаза. [39] Оваа интеракција ја инхибира синтезата на тетрахидрофолат, исклучувајќи го производството на ДНК, РНК и протеини. [39] Инхибицијата на оваа функција го потиснува неопластичниот раст и ја подобрува тешката псоријаза и ревматоидниот артритис кај возрасните. [38]

Кај кардиоваскуларни заболувања, лекови како што се бета блокаторите се користат за лекување на пациенти со хипертензија. Бета-блокаторите (β-блокатори) се антихипертензивни агенси кои го блокираат врзувањето на хормоните адреналин и норадреналин за β1 и β2 рецепторите во срцето и крвните садови. Овие рецептори вообичаено посредуваат во симпатичкиот одговор „бори се или бегај“, предизвикувајќи стегање на крвните садови. [40]

Конкурентните инхибитори исто така во голема мера се наоѓаат комерцијално. Ботулинскиот токсин, комерцијално познат како ботокс, е невротоксин што предизвикува флакцидна парализа во мускулите поради врзување за нервите зависни од ацетилхолин. Оваа интеракција ги инхибира мускулните контракции, давајќи изглед на мазни мускули. [41]

Развиени се голем број пресметковни алатки за предвидување на локацијата на местата за врзување на протеините. [21] [42] [43] Овие може да се класифицираат нашироко во секвенци базирани или базирани на структура. [43] Методите засновани на секвенца се потпираат на претпоставката дека секвенците на функционално конзервираните делови од протеините како што е местото на врзување се зачувани. Методите базирани на структура бараат 3D структура на протеинот. Овие методи за возврат може да се поделат на шаблони и методи базирани на џеб. [43] Методите базирани на шаблони бараат 3Д сличности помеѓу целниот протеин и протеините со познати места за врзување. Методите базирани на џеб бараат конкавни површини или закопани џебови во целниот протеин кои поседуваат карактеристики како што се хидрофобност и капацитет за водородно поврзување што би им овозможило да ги врзуваат лигандите со висок афинитет. [43] И покрај тоа што терминот џеб се користи овде, слични методи може да се користат за да се предвидат местата за врзување што се користат во протеинско-протеинските интеракции кои обично се порамни, а не во џебови. [44]


Содржини

Видови реверзибилни инхибитори Уреди

Реверзибилните инхибитори се прикачуваат на ензими со нековалентни интеракции како што се водородни врски, хидрофобни интеракции и јонски врски. Повеќе слаби врски помеѓу инхибиторот и активното место се комбинираат за да создадат силно и специфично врзување. За разлика од супстратите и неповратните инхибитори, реверзибилните инхибитори генерално не подлежат на хемиски реакции кога се врзуваат за ензимот и може лесно да се отстранат со разредување или дијализа.

Постојат четири вида на реверзибилни ензимски инхибитори. Тие се класифицирани според ефектот на промена на концентрацијата на супстратот на ензимот врз инхибиторот. [3] [4] [1]

  • Во конкурентна инхибиција, супстратот и инхибиторот не можат да се врзат за ензимот истовремено, како што е прикажано на сликата од десната страна. Ова обично произлегува од тоа што инхибиторот има афинитет за активното место на ензимот каде што супстратот исто така ги врзува супстратот и инхибиторот натпреваруваат за пристап до активното место на ензимот. Овој тип на инхибиција може да се надмине со доволно високи концентрации на супстрат (Вмакс останува константна), т.е. со надминување на конкуренцијата на инхибиторот. Сепак, очигледното Км ќе се зголеми бидејќи е потребна поголема концентрација на подлогата за да се достигне Км точка, или половина од Вмакс. Конкурентните инхибитори често се слични по структура со реалниот супстрат (види примери подолу).
  • Во неконкурентна инхибиција, инхибиторот се врзува само за супстрат-ензимскиот комплекс. Овој тип на инхибиција предизвикува Вмакс да се намали (максималната брзина се намалува како резултат на отстранување на активираниот комплекс) и Км да се намали (поради подобрата врзувачка ефикасност како резултат на принципот на Le Chatelier и ефективната елиминација на ES комплексот со што се намалува Км што укажува на поголем сврзувачки афинитет).
  • Во неконкурентна инхибиција, врзувањето на инхибиторот за ензимот ја намалува неговата активност, но не влијае на врзувањето на супстратот. Како резултат на тоа, степенот на инхибиција зависи само од концентрацијата на инхибиторот. Вмакс ќе се намали поради неможноста реакцијата да продолжи како ефикасно, но Км ќе остане исто како и вистинското врзување на подлогата, по дефиниција, сепак ќе функционира правилно.
  • Во мешана инхибиција, инхибиторот може да се врзе за ензимот истовремено со супстратот на ензимот. Сепак, врзувањето на инхибиторот влијае на врзувањето на подлогата и обратно. Овој тип на инхибиција може да се намали, но не и да се надмине со зголемување на концентрациите на супстратот. Иако е можно инхибиторите од мешан тип да се врзат во активното место, овој тип на инхибиција генерално произлегува од алостеричен ефект каде што инхибиторот се врзува за различно место на ензимот. Врзувањето на инхибиторот за оваа алостерична локација ја менува конформацијата (т.е. терциерната структура или тридимензионалната форма) на ензимот, така што афинитетот на супстратот за активното место е намален.

Овие типови може да се разликуваат и по ефектот на зголемување на концентрацијата на подлогата [S] врз степенот на инхибиција предизвикана од дадена количина на инхибитор. За конкурентна инхибиција, степенот на инхибиција се намалува со зголемување на [S], за неконкурентна инхибиција степенот на инхибиција е непроменет, а за неконкурентна (исто така наречена антиконкурентна) инхибиција степенот на инхибиција се зголемува со [S]. [6]

Квантитативен опис на реверзибилна инхибиција Уреди

Реверзибилната инхибиција може да се опише квантитативно во однос на врзувањето на инхибиторот за ензимот и комплексот ензим-супстрат и неговите ефекти врз кинетичките константи на ензимот. Во класичната шема Michaelis-Menten подолу, ензимот (E) се врзува за неговиот супстрат (S) за да го формира комплексот ензим-супстрат ES. По катализата, овој комплекс се распаѓа за да го ослободи производот P и слободниот ензим. Инхибиторот (I) може да се поврзе или со E или ES со константите на дисоцијација Кјас или Кјас“, соодветно.

  • Конкурентните инхибитори можат да се врзат за Е, но не и за ЕС. Конкурентната инхибиција се зголемува Км (т.е., инхибиторот интерферира со врзувањето на подлогата), но не влијае Вмакс (инхибиторот не ја попречува катализата во ЕС бидејќи не може да се поврзе со ЕС).
  • Неконкурентните инхибитори се врзуваат за ES. Неконкурентната инхибиција ги намалува и двете Км“ и „Вмакс. Инхибиторот влијае на врзувањето на супстратот со зголемување на афинитетот на ензимот за супстратот (намалување Км) како и попречување на катализата (се намалува Вмакс).
  • Неконкурентните инхибитори имаат идентични афинитети за E и ES (Кјас = Кјас'). Неконкурентната инхибиција не се менува Км (т.е., тоа не влијае на врзувањето на подлогата), но се намалува Вмакс (т.е., врзувањето на инхибиторот ја попречува катализата).
  • Инхибиторите од мешан тип се врзуваат и за Е и за ЕС, но нивните афинитети за овие две форми на ензимот се различни (КјасКјас'). Така, инхибиторите од мешан тип влијаат врз врзувањето на подлогата (зголемување или намалување Км) и ја попречуваат катализата во комплексот ES (намалување Вмакс).

Кога ензимот има повеќе супстрати, инхибиторите може да покажат различни типови на инхибиција во зависност од тоа кој супстрат се разгледува. Ова е резултат на тоа што активното место содржи две различни места за врзување во рамките на активното место, по едно за секој супстрат. На пример, инхибиторот може да се натпреварува со супстратот А за првото сврзувачко место, но да биде неконкурентен инхибитор во однос на супстратот Б во второто сврзувачко место. [7]

Мерење на константите на дисоцијација на реверзибилен инхибитор Уреди

Како што е наведено погоре, ензимскиот инхибитор се карактеризира со неговите две константи на дисоцијација, Кјас и Кјас', на ензимот и на комплексот ензим-супстрат, соодветно. Константа на ензим-инхибитор Кјас може да се мери директно со различни методи, еден исклучително точен метод е изотермална титрациона калориметрија, во која инхибиторот се титрира во раствор од ензим и се мери ослободената или апсорбираната топлина. [8] Меѓутоа, другата константа на дисоцијација КјасТешко е директно да се измери, бидејќи комплексот ензим-супстрат е краткотраен и е подложен на хемиска реакција за да се формира производот. Оттука, Кјас' обично се мери индиректно, со набљудување на ензимската активност под различни концентрации на супстрат и инхибитор, и приспособување на податоците [9] на изменета равенка Michaelis-Menten

каде што модифицирачките фактори α и α' се дефинирани со концентрацијата на инхибиторот и неговите две константи на дисоцијација

Така, во присуство на инхибиторот, ензимот е ефикасен Км и Вмакс станува (α/α')Км и (1/α')Вмакс, соодветно. Сепак, изменетата равенка Михаелис-Ментен претпоставува дека врзувањето на инхибиторот со ензимот достигна рамнотежа, што може да биде многу бавен процес за инхибитори со субнаномоларни константи на дисоцијација. Во овие случаи, обично е попрактично да се третира инхибиторот со цврсто врзување како неповратен инхибитор (види подолу), сепак, сепак може да биде можно да се процени КјасКинетички ако Кјас се мери независно.

Ефектите на различните типови на реверзибилни ензимски инхибитори врз ензимската активност може да се визуелизираат со користење на графички прикази на равенката Михаелис-Ментен, како што се графиците Линевивер-Бурк, графиците на Еди-Хофсти или Ханес-Вулфот. На пример, во парцелите Lineweaver-Burk десно, линиите на конкурентна инхибиција се сечат на y-оска, што илустрира дека таквите инхибитори не влијаат Вмакс. Слично на тоа, неконкурентните линии на инхибиција се сечат на x-оската, покажувајќи дека овие инхибитори не влијаат Км. Сепак, може да биде тешко да се процени Кјас и Кјаспрецизно од такви графици, [10] па затоа е препорачливо да се проценат овие константи користејќи посигурни нелинеарни методи на регресија, како што е опишано погоре.

Реверзибилни инхибитори Уреди

Традиционално реверзибилните ензимски инхибитори се класифицирани како конкурентни, неконкурентни или неконкурентни, според нивните ефекти врз Км и Вмакс. Овие различни ефекти произлегуваат од врзувањето на инхибиторот за ензимот Е, за комплексот ензим-супстрат ES, или за двете, соодветно. Поделбата на овие класи произлегува од проблем во нивното изведување и резултира со потреба да се користат две различни врзувачки константи за еден сврзувачки настан. Врзувањето на инхибиторот и неговиот ефект врз ензимската активност се две јасно различни работи, уште еден проблем што традиционалните равенки не успеваат да го признаат. Во неконкурентна инхибиција, врзувањето на инхибиторот резултира со 100% инхибиција само на ензимот и не ја разгледува можноста за нешто помеѓу. [11] Вообичаената форма на инхибиторниот термин, исто така, ја замаглува врската помеѓу инхибиторот што се врзува за ензимот и неговата врска со кој било друг врзувачки термин, било да е тоа равенката Michaelis-Menten или кривата на одговор на дозата поврзана со врзувањето на рецепторот на лигандот. За да се демонстрира врската, може да се направи следното преуредување:

Ова преуредување покажува дека слично на равенката Михаелис-Ментен, максималната брзина на реакција зависи од процентот на ензимската популација која комуницира со неговиот супстрат.

дел од ензимската популација врзана со супстрат

дел од ензимската популација врзана со инхибитор

ефектот на инхибиторот е резултат на процентот на ензимската популација во интеракција со инхибиторот. Единствениот проблем со оваа равенка во нејзината сегашна форма е тоа што претпоставува апсолутна инхибиција на ензимот со врзување на инхибиторот, кога всушност може да има широк опсег на ефекти некаде од 100% инхибиција на превртување на супстратот до само >0%. За да се објасни ова, равенката може лесно да се измени за да овозможи различни степени на инхибиција со вклучување на делта Вмакс термин.

Овој термин потоа може да ја дефинира резидуалната ензимска активност присутна кога инхибиторот е во интеракција со поединечни ензими во популацијата. Сепак, вклучувањето на овој термин има додадена вредност што овозможува можност за активирање доколку секундарниот Вмакс терминот се покажува повисок од почетниот член. За да се земе предвид веројатноста за активирање, ознаката потоа може да се препише заменувајќи го инхибиторот "I" со термин за модификатор означен овде како "X".

Иако оваа терминологија резултира со поедноставен начин на справување со кинетичките ефекти кои се однесуваат на максималната брзина на равенката Михаелис-Ментен, таа ги истакнува потенцијалните проблеми со терминот што се користи за опишување ефекти поврзани со Км. На Км кои се однесуваат на афинитетот на ензимот за супстратот во повеќето случаи треба да се однесуваат на потенцијални промени во местото на врзување на ензимот што директно би резултирало од интеракциите на ензимските инхибитори. Како таков термин сличен на оној предложен погоре за модулирање Вмакс треба да биде соодветно во повеќето ситуации: [12]

Специјални случаи Уреди

  • Механизмот на делумно конкурентна инхибиција е сличен на оној на неконкурентниот, освен што комплексот EIS има каталитичка активност, која може да биде помала или дури повисока (делумно конкурентна активација) од онаа на комплексот ензим-супстрат (ES). Оваа инхибиција обично покажува пониска Вмакс, но непроменета Км вредност. [13]
  • Неконкурентна инхибиција се јавува кога инхибиторот се врзува само за комплексот ензим-супстрат, а не и за слободниот ензим, комплексот EIS е каталитички неактивен. Овој начин на инхибиција е редок и предизвикува намалување на двете Вмакс и на Км вредност. [13]
  • Инхибиција на подлогата и производот е местото каде што или супстратот или производот на ензимската реакција ја инхибираат активноста на ензимот. Оваа инхибиција може да ги следи конкурентните, неконкурентните или мешаните модели. При инхибиција на подлогата, постои прогресивно намалување на активноста при високи концентрации на супстратот. Ова може да укаже на постоење на две места за врзување на супстратот во ензимот. [1] При низок супстрат, местото со висок афинитет е зафатено и се следи нормалната кинетика. Меѓутоа, при повисоки концентрации, второто инхибиторно место станува окупирано, инхибирајќи го ензимот. [14] Инхибицијата на производот често е регулаторна карактеристика во метаболизмот и може да биде форма на негативна повратна информација.
  • Бавно-тесна инхибиција се случува кога иницијалниот ензим-инхибитор комплекс ЕИ се подложува на изомеризација до втор поцврсто задржан комплекс, ЕИ*, но целокупниот процес на инхибиција е реверзибилен. Ова се манифестира како бавно зголемена ензимска инхибиција. Под овие услови, традиционалната кинетика на Michaelis-Menten дава лажна вредност за Кјас, што зависи од времето. [1] Вистинската вредност на Кјас може да се добие преку покомплексна анализа на на (кна) и исклучено (кисклучен) константи на брзина за асоцијација на инхибитори. Видете неповратна инхибиција подолу за повеќе информации.
  • Би-супстратни аналогни инхибитори се инхибитори со висок афинитет и селективност кои можат да се подготват за ензими кои катализираат би-молекуларни реакции со зафаќање на енергијата на врзување на секој супстрат во една молекула. [15][16] На пример, во реакциите на трансфер на формал на пуринската биосинтеза, моќен мулти-супстратен аддукт инхибитор (MAI) на GAR TFase беше синтетички подготвен со поврзување на аналози на супстратот глицинамид рибонуклеотид (GAR) и N-10 -формил тетрахидрофолат кофактор заедно за да произведат тиоглицинамид рибонуклеотид дидеазафолат (TGDDF), [17] или ензимски од природниот GAR супстрат за да се добие GDDF. [18] Овде субнаномоларната константа на дисоцијација (KD) на TGDDF беше поголема од предвиденото веројатно поради ентропските предности добиени и/или позитивните интеракции стекнати преку атомите што ги поврзуваат компонентите. Исто така, забележано е дека МАИ се произведуваат во клетките со реакции на про-лекови како што се изонијазид[19] или лиганди на ензимски инхибитори (на пример, PTC124) [20] со клеточни кофактори како NADH и ATP соодветно.

Примери на реверзибилни инхибитори Уреди

Бидејќи ензимите еволуирале за цврсто да ги врзуваат нивните супстрати, а повеќето реверзибилни инхибитори се врзуваат во активното место на ензимите, не е изненадувачки што некои од овие инхибитори се неверојатно слични по структура со супстратите на нивните цели. Инхибиторите на DHFR се истакнати примери. Друг пример за овие имитирачки супстрати се инхибиторите на протеазата, многу успешна класа на антиретровирусни лекови кои се користат за лекување на ХИВ. [21] Структурата на ритонавир, инхибитор на протеаза базиран на пептид и кој содржи три пептидни врски, е прикажана на десната страна. Бидејќи овој лек наликува на протеинот кој е супстрат на ХИВ протеазата, тој се натпреварува со овој супстрат во активното место на ензимот.

Ензимските инхибитори често се дизајнирани да ја имитираат транзициската состојба или посредник на ензимски катализирана реакција. Ова осигурува дека инхибиторот го користи ефектот на стабилизирање на транзициската состојба на ензимот, што резултира со подобар сврзувачки афинитет (понизок Кјас) отколку дизајни базирани на подлога. Пример за таков инхибитор на транзициска состојба е антивирусниот лек оселтамивир, овој лек ја имитира рамнината на прстенестиот оксониум јони во реакцијата на вирусниот ензим неураминидаза. [22]

Сепак, не сите инхибитори се базираат на структурите на супстратите. На пример, структурата на друг инхибитор на ХИВ протеазата типранавир е прикажана лево. Оваа молекула не се базира на пептид и нема очигледна структурна сличност со протеинскиот супстрат. Овие непептидни инхибитори можат да бидат постабилни од инхибиторите кои содржат пептидни врски, бидејќи тие нема да бидат супстрати за пептидазите и имаат помала веројатност да се разградат. [23]

Во дизајнот на лекот важно е да се земат предвид концентрациите на супстратите на кои се изложени целните ензими. На пример, некои инхибитори на протеин киназа имаат хемиски структури кои се слични на аденозин трифосфат, еден од супстратите на овие ензими. Сепак, лековите кои се едноставни конкурентни инхибитори ќе мора да се натпреваруваат со високите концентрации на АТП во клетката. Протеинските кинази, исто така, можат да бидат инхибирани со конкуренција на местата за врзување каде што киназите комуницираат со нивните супстратни протеини, а повеќето протеини се присутни во клетките во концентрации многу пониски од концентрацијата на АТП. Како последица на тоа, ако двата инхибитори на протеин киназа се врзат во активното место со сличен афинитет, но само еден треба да се натпреварува со АТП, тогаш конкурентниот инхибитор на местото за врзување на протеините ќе го инхибира ензимот поефикасно. [24]

Видови на неповратна инхибиција (ковалентна инактивација) Уреди

Иреверзибилните инхибитори обично ковалентно го модифицираат ензимот и затоа инхибицијата не може да се врати назад. Иреверзибилните инхибитори често содржат реактивни функционални групи како што се азотни сенфови, алдехиди, халоалкани, алкени, Мајкл акцептори, фенил сулфонати или флуорофосфонати. Овие нуклеофилни групи реагираат со страничните синџири на аминокиселини за да формираат ковалентни адукти. Остатоците што се модифицирани се оние со странични синџири кои содржат нуклеофили како што се хидроксилни или сулфхидрилни групи кои ги вклучуваат амино киселините серин (како во DFP, десно), цистеин, треонин или тирозин. [25]

Иреверзибилната инхибиција се разликува од неповратната ензимска инактивација. Иреверзибилните инхибитори се генерално специфични за една класа на ензими и не ги деактивираат сите протеини, тие не функционираат со уништување на структурата на протеините, туку со специфично менување на активното место на нивната цел. На пример, екстремите на pH или температурата обично предизвикуваат денатурација на целата протеинска структура, но ова е неспецифичен ефект. Слично на тоа, некои неспецифични хемиски третмани ја уништуваат структурата на протеините: на пример, загревањето во концентрирана хлороводородна киселина ќе ги хидролизира пептидните врски што ги држат протеините заедно, ослободувајќи слободни амино киселини. [26]

Irreversible inhibitors display time-dependent inhibition and their potency therefore cannot be characterised by an IC50 вредност. [1] [27] This is because the amount of active enzyme at a given concentration of irreversible inhibitor will be different depending on how long the inhibitor is pre-incubated with the enzyme. Наместо тоа, копс/[Јас] values are used, [28] where копс is the observed pseudo-first order rate of inactivation (obtained by plotting the log of % activity vs. time) and [Јас] is the concentration of inhibitor. На копс/[Јас] parameter is valid as long as the inhibitor does not saturate binding with the enzyme (in which case копс = кinact).

Analysis of irreversible inhibition Edit

As shown in the figure to the right, irreversible inhibitors have a short instance where they form a reversible non-covalent complex with the enzyme (EI or ESI) and this then reacts to produce the covalently modified "dead-end complex" EI* (an irreversible covalent complex). The rate at which EI* is formed is called the inactivation rate or кinact. Since formation of EI may compete with ES, binding of irreversible inhibitors can be prevented by competition either with substrate or with a second, reversible inhibitor. This protection effect is good evidence of a specific reaction of the irreversible inhibitor with the active site.

The binding and inactivation steps of this reaction are investigated by incubating the enzyme with inhibitor and assaying the amount of activity remaining over time. The activity will be decreased in a time-dependent manner, usually following exponential decay. Fitting these data to a rate equation gives the rate of inactivation at this concentration of inhibitor. This is done at several different concentrations of inhibitor. If a reversible EI complex is involved the inactivation rate will be saturable and fitting this curve will give кinact и Кјас. [29]

Another method that is widely used in these analyses is mass spectrometry. Here, accurate measurement of the mass of the unmodified native enzyme and the inactivated enzyme gives the increase in mass caused by reaction with the inhibitor and shows the stoichiometry of the reaction. [30] This is usually done using a MALDI-TOF mass spectrometer. In a complementary technique, peptide mass fingerprinting involves digestion of the native and modified protein with a protease such as trypsin. This will produce a set of peptides that can be analysed using a mass spectrometer. The peptide that changes in mass after reaction with the inhibitor will be the one that contains the site of modification.

Special cases Edit

Not all irreversible inhibitors form covalent adducts with their enzyme targets. Some reversible inhibitors bind so tightly to their target enzyme that they are essentially irreversible. These tight-binding inhibitors may show kinetics similar to covalent irreversible inhibitors. In these cases, some of these inhibitors rapidly bind to the enzyme in a low-affinity EI complex and this then undergoes a slower rearrangement to a very tightly bound EI* complex (see figure above). This kinetic behaviour is called slow-binding. [32] This slow rearrangement after binding often involves a conformational change as the enzyme "clamps down" around the inhibitor molecule. Examples of slow-binding inhibitors include some important drugs, such methotrexate, [33] allopurinol, [34] and the activated form of acyclovir. [35]

Examples of irreversible inhibitors Edit

Diisopropylfluorophosphate (DFP) is shown as an example of an irreversible protease inhibitor in the figure above right. The enzyme hydrolyses the phosphorus–fluorine bond, but the phosphate residue remains bound to the serine in the active site, deactivating it. [36] Similarly, DFP also reacts with the active site of acetylcholine esterase in the synapses of neurons, and consequently is a potent neurotoxin, with a lethal dose of less than 100 mg. [37]

Suicide inhibition is an unusual type of irreversible inhibition where the enzyme converts the inhibitor into a reactive form in its active site. An example is the inhibitor of polyamine biosynthesis, α-difluoromethylornithine or DFMO, which is an analogue of the amino acid ornithine, and is used to treat African trypanosomiasis (sleeping sickness). Ornithine decarboxylase can catalyse the decarboxylation of DFMO instead of ornithine, as shown above. However, this decarboxylation reaction is followed by the elimination of a fluorine atom, which converts this catalytic intermediate into a conjugated imine, a highly electrophilic species. This reactive form of DFMO then reacts with either a cysteine or lysine residue in the active site to irreversibly inactivate the enzyme. [31]

Since irreversible inhibition often involves the initial formation of a non-covalent EI complex, it is sometimes possible for an inhibitor to bind to an enzyme in more than one way. For example, in the figure showing trypanothione reductase from the human protozoan parasite Trypanosoma cruzi, two molecules of an inhibitor called quinacrine mustard are bound in its active site. The top molecule is bound reversibly, but the lower one is bound covalently as it has reacted with an amino acid residue through its nitrogen mustard group. [38]

New drugs are the products of a long drug development process, the first step of which is often the discovery of a new enzyme inhibitor. In the past the only way to discover these new inhibitors was by trial and error: screening huge libraries of compounds against a target enzyme and hoping that some useful leads would emerge. This brute force approach is still successful and has even been extended by combinatorial chemistry approaches that quickly produce large numbers of novel compounds and high-throughput screening technology to rapidly screen these huge chemical libraries for useful inhibitors. [39]

More recently, an alternative approach has been applied: rational drug design uses the three-dimensional structure of an enzyme's active site to predict which molecules might be inhibitors. [40] These predictions are then tested and one of these tested compounds may be a novel inhibitor. This new inhibitor is then used to try to obtain a structure of the enzyme in an inhibitor/enzyme complex to show how the molecule is binding to the active site, allowing changes to be made to the inhibitor to try to optimise binding. This test and improve cycle is then repeated until a sufficiently potent inhibitor is produced. [41] Computer-based methods of predicting the affinity of an inhibitor for an enzyme are also being developed, such as molecular docking [42] and molecular mechanics.

Enzyme inhibitors are found in nature and are also designed and produced as part of pharmacology and biochemistry. Natural poisons are often enzyme inhibitors that have evolved to defend a plant or animal against predators. These natural toxins include some of the most poisonous compounds known. Artificial inhibitors are often used as drugs, but can also be insecticides such as malathion, herbicides such as glyphosate, or disinfectants such as triclosan. Other artificial enzyme inhibitors block acetylcholinesterase, an enzyme which breaks down acetylcholine, and are used as nerve agents in chemical warfare.

Chemotherapy Edit

The most common uses for enzyme inhibitors are as drugs to treat disease. Many of these inhibitors target a human enzyme and aim to correct a pathological condition. However, not all drugs are enzyme inhibitors. Some, such as anti-epileptic drugs, alter enzyme activity by causing more or less of the enzyme to be produced. These effects are called enzyme induction and inhibition and are alterations in gene expression, which is unrelated to the type of enzyme inhibition discussed here. Other drugs interact with cellular targets that are not enzymes, such as ion channels or membrane receptors.

An example of a medicinal enzyme inhibitor is sildenafil (Viagra), a common treatment for male erectile dysfunction. This compound is a potent inhibitor of cGMP specific phosphodiesterase type 5, the enzyme that degrades the signalling molecule cyclic guanosine monophosphate. [43] This signalling molecule triggers smooth muscle relaxation and allows blood flow into the corpus cavernosum, which causes an erection. Since the drug decreases the activity of the enzyme that halts the signal, it makes this signal last for a longer period of time.

Another example of the structural similarity of some inhibitors to the substrates of the enzymes they target is seen in the figure comparing the drug methotrexate to folic acid. Folic acid is a substrate of dihydrofolate reductase, an enzyme involved in making nucleotides that is potently inhibited by methotrexate. Methotrexate blocks the action of dihydrofolate reductase and thereby halts the production of nucleotides. This block of nucleotide biosynthesis is more toxic to rapidly growing cells than non-dividing cells, since a rapidly growing cell has to carry out DNA replication, therefore methotrexate is often used in cancer chemotherapy. [44]

Antibiotics Edit

Drugs also are used to inhibit enzymes needed for the survival of pathogens. For example, bacteria are surrounded by a thick cell wall made of a net-like polymer called peptidoglycan. Many antibiotics such as penicillin and vancomycin inhibit the enzymes that produce and then cross-link the strands of this polymer together. [45] This causes the cell wall to lose strength and the bacteria to burst. In the figure, a molecule of penicillin (shown in a ball-and-stick form) is shown bound to its target, the transpeptidase from the bacteria Стрептомици R61 (the protein is shown as a ribbon-diagram).

Antibiotic drug design is facilitated when an enzyme that is essential to the pathogen's survival is absent or very different in humans. In the example above, humans do not make peptidoglycan, therefore inhibitors of this process are selectively toxic to bacteria. Selective toxicity is also produced in antibiotics by exploiting differences in the structure of the ribosomes in bacteria, or how they make fatty acids.

Metabolic control Edit

Enzyme inhibitors are also important in metabolic control. Many metabolic pathways in the cell are inhibited by metabolites that control enzyme activity through allosteric regulation or substrate inhibition. A good example is the allosteric regulation of the glycolytic pathway. This catabolic pathway consumes glucose and produces ATP, NADH and pyruvate. A key step for the regulation of glycolysis is an early reaction in the pathway catalysed by phosphofructokinase-1 (PFK1). When ATP levels rise, ATP binds an allosteric site in PFK1 to decrease the rate of the enzyme reaction glycolysis is inhibited and ATP production falls. This negative feedback control helps maintain a steady concentration of ATP in the cell. However, metabolic pathways are not just regulated through inhibition since enzyme activation is equally important. With respect to PFK1, fructose 2,6-bisphosphate and ADP are examples of metabolites that are allosteric activators. [46]

Physiological enzyme inhibition can also be produced by specific protein inhibitors. This mechanism occurs in the pancreas, which synthesises many digestive precursor enzymes known as zymogens. Many of these are activated by the trypsin protease, so it is important to inhibit the activity of trypsin in the pancreas to prevent the organ from digesting itself. One way in which the activity of trypsin is controlled is the production of a specific and potent trypsin inhibitor protein in the pancreas. This inhibitor binds tightly to trypsin, preventing the trypsin activity that would otherwise be detrimental to the organ. [47] Although the trypsin inhibitor is a protein, it avoids being hydrolysed as a substrate by the protease by excluding water from trypsin's active site and destabilising the transition state. [48] Other examples of physiological enzyme inhibitor proteins include the barstar inhibitor of the bacterial ribonuclease barnase. [49]

Пестициди Уреди

Many pesticides are enzyme inhibitors. Acetylcholinesterase (AChE) is an enzyme found in animals, from insects to humans. It is essential to nerve cell function through its mechanism of breaking down the neurotransmitter acetylcholine into its constituents, acetate and choline. This is somewhat unusual among neurotransmitters as most, including serotonin, dopamine, and norepinephrine, are absorbed from the synaptic cleft rather than cleaved. A large number of AChE inhibitors are used in both medicine and agriculture. Reversible competitive inhibitors, such as edrophonium, physostigmine, and neostigmine, are used in the treatment of myasthenia gravis and in anaesthesia. The carbamate pesticides are also examples of reversible AChE inhibitors. The organophosphate pesticides such as malathion, parathion, and chlorpyrifos irreversibly inhibit acetylcholinesterase.

The herbicide glyphosate is an inhibitor of 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase, [50] other herbicides, such as the sulfonylureas inhibit the enzyme acetolactate synthase. Both these enzymes are needed for plants to make branched-chain amino acids. Many other enzymes are inhibited by herbicides, including enzymes needed for the biosynthesis of lipids and carotenoids and the processes of photosynthesis and oxidative phosphorylation. [51]

Natural poisons Edit

Animals and plants have evolved to synthesise a vast array of poisonous products including secondary metabolites, peptides and proteins that can act as inhibitors. Natural toxins are usually small organic molecules and are so diverse that there are probably natural inhibitors for most metabolic processes. [52] The metabolic processes targeted by natural poisons encompass more than enzymes in metabolic pathways and can also include the inhibition of receptor, channel and structural protein functions in a cell. For example, paclitaxel (taxol), an organic molecule found in the Pacific yew tree, binds tightly to tubulin dimers and inhibits their assembly into microtubules in the cytoskeleton. [53]

Many natural poisons act as neurotoxins that can cause paralysis leading to death and have functions for defence against predators or in hunting and capturing prey. Some of these natural inhibitors, despite their toxic attributes, are valuable for therapeutic uses at lower doses. [54] An example of a neurotoxin are the glycoalkaloids, from the plant species in the family Solanaceae (includes potato, tomato and eggplant), that are acetylcholinesterase inhibitors. Inhibition of this enzyme causes an uncontrolled increase in the acetylcholine neurotransmitter, muscular paralysis and then death. Neurotoxicity can also result from the inhibition of receptors for example, atropine from deadly nightshade (Atropa belladonna) that functions as a competitive antagonist of the muscarinic acetylcholine receptors. [55]

Although many natural toxins are secondary metabolites, these poisons also include peptides and proteins. An example of a toxic peptide is alpha-amanitin, which is found in relatives of the death cap mushroom. This is a potent enzyme inhibitor, in this case preventing the RNA polymerase II enzyme from transcribing DNA. [56] The algal toxin microcystin is also a peptide and is an inhibitor of protein phosphatases. [57] This toxin can contaminate water supplies after algal blooms and is a known carcinogen that can also cause acute liver hemorrhage and death at higher doses. [58]

Proteins can also be natural poisons or antinutrients, such as the trypsin inhibitors (discussed above) that are found in some legumes, as shown in the figure above. A less common class of toxins are toxic enzymes: these act as irreversible inhibitors of their target enzymes and work by chemically modifying their substrate enzymes. An example is ricin, an extremely potent protein toxin found in castor oil beans. This enzyme is a glycosidase that inactivates ribosomes. Since ricin is a catalytic irreversible inhibitor, this allows just a single molecule of ricin to kill a cell. [59]


Mechanism of Transformation (With Diagram) | Генетика

Notani and Setlow (1974) have described the mechanism of bacterial transformation. Moreover, in S. pneumoniae the competent state is transient and persists only for a short period. The competent state is induced by the competence activator protein of molecular weight of 1,000 Dalton.

It binds to the plasma membrane of receptor and triggers the synthesis of 10 new proteins within 10 minutes. The competence factor (CF) accelerates the process of transport or leakage of autolysin molecules into the periplasmic space. Moreover, in H. influenzae no competence factors have been reported.

Only Changes in cell envelope accompany the development of competence state. The cell envelope of competent cells contains increased level of polysacccharide as compared to the cells of log phase.

Structural changes in competent cells induce numerous vesicles called transformosome buds on the surface that contains protein and mediates the uptake of transforming DNA. Transformation is accomplished in the following steps (Fig.8.4).

Fig. 8.4 : Diagrammatic presentation of transformation in streptococci.

As a result of random collision, DNA comes first in the contact of cell surface of competent bacteria (Figs. 8.4 and 8.5 A-B). First the DNA binding is reversible and lasts for about 4-5 seconds. Thereafter, it becomes irreversible permanently. For about 2 minutes it remains in non-transforming state. Thereafter, before 5 minutes it is converted into the transforming state.

The period (about 10 minutes) during which no transformation occurs in competent recipient cells is called eclipse. Both types of DNA, transforming and non-transforming, bind to the cell surface where the receptor sites are located. In B. subtilis membrane vesicles in competent cells are found that bind to 20 mg of dsDNA/mg of membrane protein. The competent cells show six fold more DNA binding sites than the non-competent cells.

In H influenzae transformosome bud forms the surface and contains proteins that mediate DNA uptake. It binds with conserved sequence (5’AAGTGCGGTCA 3′) present at 4 kb interval on DNA. The DNA uptake site contains two proteins of 28 and 52 kilo-Daltons. After binding, the receptor proteins present the donor DNA to the membrane associated uptake sites.

In S. pneumoniae the CF induces the ability to bind DNA molecules.

The DNA molecules that bind permanently enter the competent recipient cells. DNA is also resistant to DNase degradation. The nucleolytic enzymes located at the surface of competent recipient cells act upon the donor DNA molecule when it binds the cell membrane.

The endonuclease-1 of the recipient cells which is associated with cell membrane acts as DNA translocase by attacking and degrading one strand of the dsDNA. Consequently only complementary single strand of DNA enters into the recipient cells (Figs. 8.4 and 8.5A).

It has been confirmed by performing the experiments with radiolabelling of donor DNA. The mutant cells of S. pneumoniae lack endonuclease – 1, therefore, transformation does not occur. Interestingly in B. subtilis degradation of one strand is being delayed. Hence, both the strands enter the recipient cell. The upper limit of peneterating DNA into the recipient cell is about 750 base pairs.

The size of donor DNA affects transformation. Successful transformation occurs with the donor DN.A of molecular weight between 30,00,000 and 8 million Dalton. With increasing the concentration of donor DNA the number of competent cells increases. DNA uptake process is the energy requiring mechanism because it can be inhibited by the energy requiring inhibitors.

After penetration the donor DNA migrates from periphery of cell to the bacterial DNA. This movement in different bacteria differs. For example, in B. subtilis this movement occurs for about 16-60 minutes. During this movement, DNA is associated with mesosomes which possibly transport it to the bacterial DNA.

(в) Synapsis formation:

The single stranded DNA is coated with SSB proteins, which maintain, the single stranded region in a replication fork (Fig. 8.5B). The single strand of the donor DNA or portion of it is linearly inserted into the recipient DNA (Fig. 8.5 C-D). The bacterial protein like E. coli RecA protein probably facilitates the DNA pairing during recombination. It causes the local unwinding of dsDNA of the recipient cell from the 5′ end.

How the displaced single strand is cut, still not known? Base pairing i.e. synapsis occurs between the homologous donor ssDNA and the recipient DNA. Unwinding of the recipient DNA continues at the end of assimilated DNA and allows the fraction of invading DNA to increase base pairs. This process is called branch migration (F).

The endonuclease cuts the unpaired free end of donor DNA or the recipient DNA. This process is called trimming (Fig. 8.5E-F). The nick is sealed by DNA ligase (G). Consequently, a heteroduplex region containing a mismatched base pairs is formed (H). Furthermore, in the progenies whether the donor marker is or is not recovered, depends on the occurrence of mismatch repair.

If the mismatch repair occurs again, it depends whether the unpaired base in the donor or recipient strand is removed. After replication the heteroduplex forms the homo-duplexes, one of these is of normal type and the second is transformed duplex. The normal duplex is from the recipient cell in origin, whereas the transformed duplex is from the donor genome.

The efficiency of integration of genetic markers into the genome of recipient cell varies with different genes that the recipient cell possesses. This genetic trait is called hex (high efficiency of integration). The hex system eliminates a large fraction of low efficiency (LE) markers and permits high efficiency (HE) markers to be integrated. Therefore, the hex function is a mismatch-base correction system.

The donor genes differing from the recipient genes by a single base pair create a mismatch when integrated initially. The hex mismatch repair system (with LE markers) can correct either of donor strands. Therefore, there is fifty-fifty chance for a given marker to be retained. The HE markers correct only the recipient strand.

For the LE markers, hex mismatch repair system unusually removes the mismatched bases of the donor DNA and the cell retains the recipient genotype, whereas for HE markers the same system removes the mismatched bases of recipient DNA and the cell consists of donor genotype.

In the later case, after replication of chromosome and cell division the one progeny cell contains the donor genotype and the other has the recipient genotype. These two types of cells can be differentiated through plating method by using the antibiotic markers.

However, for pneumococci it is a general feature that all the strains discriminate between LH and HE markers when transformation has occurred with homologous DNA. The hex – cells (mutant in hex function) fail to discriminate between the two markers and, therefore, integrate all markers with high efficiency, because one of the two daughter cells after cell division contains the genotype.


Summary – Reversible vs Irreversible Inhibition

Enzyme inhibition can be either reversible or irreversible. In summarizing the difference between reversible and irreversible inhibition in reversible inhibition, the inhibitor binds with the enzyme non-covalently. Hence, the unbinding of the inhibitor from the enzyme is easy and rapid. On the other hand, in irreversible inhibition, the inhibitor binds with the enzyme covalently. Therefore, the inhibitor strongly binds with the enzyme and the dissociation of the enzyme-inhibitor complex is slow and hard. Therefore, this is the key difference between reversible and irreversible inhibition. Furthermore, in reversible inhibition, the reaction can be reversed, and the enzyme can be reactivated again. But in irreversible inhibition, the reaction cannot be reversed, and the enzyme cannot be activated again.

Референца:

1. “Enzyme Inhibitor.” Wikipedia, Wikimedia Foundation, 1 Jan. 2019. Available here
2. “Enzyme Inhibitor.” NeuroImage, Academic Press. Достапно овде

Слика со учтивост:

1.”DHFR methotrexate inhibitor”By Thomas Shafee – Own work, (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia
2.”Covalent-drugs-silence-proteins”By Dr. Juswinder Singh (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia


5A: Introduction to Reversible Binding - Biology

There are two types of reversible inhibitors:

In both cases reversible inhibitors can be removed from the enzymes - but only under certain conditions.

Конкурентна инхибиција

Competitive inhibitors are inhibitors that compete with substrates for the active site. They resemble the substrate in that they can fit into the active site,fooling the enzyme into thinking that they are substrates. They differ from the substrate in that they are unreactive. They therefore reduce the number of enzymes available to catalyse a reaction. If there is enough substrate available though, the chances of an enzyme attracting an inhibitor is smaller - most enzymes will still attract the correct substrates and a reaction can still occur. To help overcome the effect of a competitive inhibitor, the substrate concentration should be increased. The inhibitors usually leave the active site when the substrate concentration is high enough.


Inhibitors are not always poisons or harmful. An example of an inhibitor used in treating poisons is in poisoning. Ethylene glycol is a component of car antifreezes. By itself it is a harmless substance but it is broken down in the body into oxalic acid (a deadly poison) by the enzyme, alcohol dehydrogenase. Alcohol (ethanol) acts as a competitive inhibitor for alcohol dehydrogenase. Giving the patient large amounts of alcohol will cause the ethanol to compete with ethylene glycol for the active site of alcohol dehydrogenase. Alcohol is the preferred substrate for alcohol dehydrogenase so when it is present, it binds with the enzyme. After a while, the ethylene glycol is harmlessly excreted.

Various poisons such as cyanide, arsenic and mercury - in fact many heavy metal ions - act as inhibitors. HCN binds to the active site of various cytochromases which are enzymes that are responsible for catalysing oxidation and reduction processes in cellular respiration. Many diet pills of the 1920s contained arsenic! These inhibited certain digestive enzymes in the human alimentary canal.

Non-competitive inhibition

These substances do not bind to the active site of an enzyme, but rather to other parts of the enzyme. In doing so, they may change the conformation of the active site as has already been explained (breaking certain hydrogen bonds and forming incorrect ones, changing the shape of the active site) and possibly inactivate it.

A non-competitive inhibitor will eventually leave the binding site. Substrate molecules have nothing to do with this, as these inhibitors do not bind to the active site, and therefore have a greater inhibitory effect. A greater substrate concentration will not help as substrate molecules only compete for positions at the active site. Examples include lead, mercury and chromium.


Many pesticides and herbicides are also inhibitors. Read the pamphlet inside the boxes of garden or household poisons and see how these function. Look at medicine pamphlets as well. You will often find that many use inhibitors that block active sites of bacterial enzymes, killing them or stopping their reproduction. Some painkillers also act as inhibitors, eg aspirin.

Објаснување

When a competitive inhibitor is present, the enzyme activity is decreased compared to when no inhibitor is present. As the substrate concentration is increased, the activity eventually becomes the same.

You will notice that the optimum substrate concentration is much higher.

With a non-competitive inhibitor, the inhibition is not dependent on the substrate concentration and the effect is similar to an irreversible inhibitor.


Реверзибилни реакции

In reversible reactions, the reactants and products are never fully consumed they are each constantly reacting and being produced. A reversible reaction can take the following summarized form:

This reversible reaction can be broken into two reactions.

Reaction 1: [ A + B xrightarrowC+D ]

Reaction 2: [ C + D xrightarrow>A+B ]

These two reactions are occurring истовремено , which means that the reactants are reacting to yield the products, as the products are reacting to produce the reactants . Collisions of the reacting molecules cause chemical reactions in a closed system. After products are formed, the bonds between these products are broken when the molecules collide with each other, producing sufficient energy needed to break the bonds of the product and reactant molecules.

Below is an example of the summarized form of a reversible reaction and a breakdown of the reversible reaction N2О4 &harr 2NO2

Reaction 1 and Reaction 2 happen at the same time because they are in a closed system.

Blue : Nitrogen Red : Oxygen

Imagine a ballroom. Let reactant A be 10 girls and reactant B be 10 boys. As each girl and boy goes to the dance floor, they pair up to become a product. Once five girls and five boys are on the dance floor, one of the five pairs breaks up and moves to the sidelines, becoming reactants again. As this pair leaves the dance floor, another boy and girl on the sidelines pair up to form a product once more. This process continues over and over again, representing a reversible reaction.

Unlike irreversible reactions, reversible reactions lead to equilibrium: in reversible reactions, the reaction proceeds in both directions whereas in irreversible reactions the reaction proceeds in only one direction. To learn more about this phenomenon, click here: Chemical Equilibrium

If the reactants are formed at the same rate as the products, a dynamic equilibrium exists. For example, if a water tank is being filled with water at the same rate as water is leaving the tank (through a hypothetical hole), the amount of water remaining in the tank remains consistent.


Reversible covalent direct thrombin inhibitors

Вовед: In recent years, the traditional treatments for thrombotic diseases, heparin and warfarin, are increasingly being replaced by novel oral anticoagulants offering convenient dosing regimens, more predictable anticoagulant responses, and less frequent monitoring. However, these drugs can be contraindicated for some patients and, in particular, their bleeding liability remains high.

Методи: We have developed a new class of direct thrombin inhibitors (VE-DTIs) and have utilized kinetics, biochemical, and X-ray structural studies to characterize the mechanism of action and in vitro pharmacology of an exemplary compound from this class, Compound 1.

Резултати: We demonstrate that Compound 1, an exemplary VE-DTI, acts through reversible covalent inhibition. Compound 1 inhibits thrombin by transiently acylating the active site S195 with high potency and significant selectivity over other trypsin-like serine proteases. The compound inhibits the binding of a peptide substrate with both clot-bound and free thrombin with nanomolar potency. Compound 1 is a low micromolar inhibitor of thrombin activity against endogenous substrates such as fibrinogen and a nanomolar inhibitor of the activation of protein C and thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor. In the thrombin generation assay, Compound 1 inhibits thrombin generation with low micromolar potency but does not increase the lag time for thrombin formation. In addition, Compound 1 showed weak inhibition of clotting in PT and aPTT assays consistent with its distinctive profile in the thrombin generation assay.

Заклучок: Compound 1, while maintaining strong potency comparable to the current DTIs, has a distinct mechanism of action which produces a differentiating pharmacological profile. Acting through reversible covalent inhibition, these direct thrombin inhibitors could lead to new anticoagulants with better combined efficacy and bleeding profiles.

Изјава за конфликт на интереси

MS, MR, KL, TPS, DMC, LI, SC, PZ, MAE, KMS, DCW, AD, and DBK are employees of Verseon Corporation. EDC discloses a financial interest in Verseon Corporation and funding through NIH grants HL049413, HL073813, and HL112303. NP discloses a financial interest in Hemadvance, LLC and funding through AHA grant AHA15SDG25550094. KMS and DCW are inventors on a patent application (WO/2014/149139) that includes Compound 1 and has local applications pending in numerous jurisdictions worldwide. This does not alter our adherence to PLOS ONE policies on sharing data and materials.

Фигури

Fig 1. Structures of Compound 1, the…

Fig 1. Structures of Compound 1, the dansylated Compound 2, and the deacylated Compound 3…

Fig 2. Interaction of Compound 1 with…

Fig 2. Interaction of Compound 1 with thrombin.

Compound 1 at 1 μM was incubated…

Fig 4. Structural model of the thrombin…

Fig 4. Structural model of the thrombin active site.

The structural model of the thrombin…

Fig 5. Interaction diagram for the thrombin…

Fig 5. Interaction diagram for the thrombin active site modified by Compound 1.

Fig 6. Kinetic characterization of Compound 1.

Fig 6. Kinetic characterization of Compound 1.

Fig 7. Spontaneous recovery of thrombin activity.

Fig 7. Spontaneous recovery of thrombin activity.

% Thrombin activity was recorded as a function…

Fig 8. Thrombograms from the thrombin generation…

Fig 8. Thrombograms from the thrombin generation assay for argatroban, dabigatran, and Compound 1.


AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF MINIMAL AMOUNT OF ACETYLCHOLINESTERASE FROM NERVOUS TISSUES AND ERYTHROCYTE MEMBRANES

Publisher Summary

This chapter discusses the affinity chromatography of minimal amount of acetylcholinesterase from nervous tissues and erythrocyte membranes. It discusses a study in which a suitable method for the selective isolation of AChE from other proteins, by affinity chromatography, was worked out by integrating and modifying three available methods. Affigel 202 (Bio-Rad) was covalently linked to a specific and reversible AChE inhibitor. This inhibitor was synthesized, and its properties as the differential inhibitor of AChE and butyrilcholinesterase (3.1.1.8.) (BuChE) were examined. The values of PI 50 were found to be 3.8, 4.0, and 2.0 for rat brain AChE, electric eel AChE, and horse serum BuChE, respectively. According to the batchwise procedure, finally adopted, the sample containing at least 60 mU was loaded onto a similar volume of the affinity chromatography gel and the unbound proteins were removed by centrifugation. After three washings with a threefold volume of saline phosphate buffer, AChE was eluted in two steps from the gel by choline chloride solution, which proved effective because of the poor affinity of the linked inhibitor for AChE. The AChE activity, recovered after centrifugation and dialysis of the supernatant, was about 90% of the activity in the sample.

Ние користиме колачиња за да помогнеме да ја обезбедиме и подобриме нашата услуга и да ги приспособиме содржините и рекламите. Продолжувајќи се согласувате со употреба на колачиња .



Коментари:

  1. Voisttitoevetz

    Yesterday the site did not work, somewhere around 12 o'clock, why?

  2. Anastagio

    Се извинувам, и јас би сакал да го искажам мислењето.

  3. Kagalar

    неспоредливо тема, ми се допаѓа)))) многу

  4. Cuong

    I apologize for being a little off topic, but what is RSS? and how to subscribe to it?



Напишете порака