Информации

Која е целта на адаптерите во форма на Y во секвенционирањето на Illumina?

Која е целта на адаптерите во форма на Y во секвенционирањето на Illumina?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Y адаптира различни секвенци што треба да се анелираат на 5' и 3' краеви на секоја молекула во библиотека.

Краците на Y се единствени, а средниот дел, поврзан со фрагментот на ДНК, е комплементарен.

Кои се предностите на ова?

Моето мислење за ова за тоа да имам целосно комплементарни адаптери (ADAPTER1 - - - - - ADAPTER1) е дека:

-При жарењето на прајмерот, прајмерот за возврат ќе се врзе за почетокот И крајот на фрагментот на ДНК и со тоа нема да дозволи синтезата да продолжи до крај. Затоа, следниот прајмер нема да има шаблон за врзување на почетокот на фрагментот…

Адаптерите во форма на Y исто така овозможуваат секвенционирање со спарени краеви. Фрагментите имаат уникатна низа на двата краја, што овозможува во првото „трчање“ да се секвенционира едната страна од сите молекули, потоа да се синтетизира обратната и да се редатира.

Дали сум на вистинскиот пат?


Вообичаено, кога ви требаат два уникатни адаптери, да речеме A & B, на двата краја на непознати секвенци на вметнувачи, кохезивното поврзување на крајот е тешко бидејќи низите на вметнување се „непознати“. Значи, треба да направите лигатура на адаптерот со тап крај, во реакција која содржи Непознати влошки + адаптер А + адаптер Б. Ова може да резултира со 3 можни верзии на производот поврзан со вметнување: A-insert-A, B-insert-B и А-вметнете-Б, меѓу кои само А-вметнете-Б е единствениот посакуван производ.

1) Лигацијата на влошки со А-опаш со Y-адаптери ви дава 100% А-вметнете-Б.

2) Ајде сега да му доделиме насока на влошката - да речеме од основата 1 до основата 400. По врзувањето на Y-адаптерот, ќе имате 2 вида производи поврзани со вметнување по вметнување: A-Вметни (1-->400)-B и A-Вметни (400-->1)-B, и двете се многу корисни. Секој од нив ќе создаде посебен клонален кластер и ќе добиете информации за секвенцата почнувајќи од базата 1 и базата 400 на влошката, бидејќи при секвенционирање со едно читање, инструментот секогаш се секвенцира од адаптерот А. Сепак, да знаете дека и двете секвенци припаѓаат на истото вметнување, ќе треба да се направи секвенционирање со парен крај.


NGS адаптери

Дали сте збунети од контаминацијата во вашиот NGS олиго?

Дали сте загрижени за ефикасноста на изградбата на библиотеката во вашиот експеримент NGS?

Дали сте свесни за високите стандарди за квалитет на NGS oligos?

Секвенционирањето на следната генерација (NGS) е широко користено во многу клинички дијагностички области, вклучувајќи ги генетските болести и ракот, неинвазивното пренатално тестирање (NIPT) и прецизната медицина поради секвенционирањето со висока пропусност, високата прецизност и изобилството на собрани информации. Соодветно на тоа, високите стандарди за квалитет на NGS олигото се протегаат надвор од чистотата и точноста кои обично се применуваат на стандардните олиго. Дополнително, треба да се земат предвид и други стандарди кои ќе влијаат на резултатите на NGS, како што се вкрстена контаминација и прецизна квантификација.

GenScript обезбедува NGS адаптери за подготовка на библиотека за врзување и тагментација, компатибилни со Illumina Truseq и Nextera. Нудиме на полицата парови на адаптери со уникатен двоен индекс (UDI) и сопствени адаптери за да одговараат на вашата платформа за секвенционирање. Нашиот строг КК гарантира многу пониска стапка на вкрстена контаминација од индустрискиот стандард.


Секвенционирање на следната генерација за почетници

Овие ресурси покриваат клучни теми во секвенционирањето на следната генерација (NGS) наменето за почетници. Ќе ве водиме низ работниот тек, упатствата и планирањето на вашиот прв експеримент.

Светското влијание на NGS

Секвенционирањето на следната генерација го револуционизира истражувањето, овозможувајќи експерименти кои претходно не беа можни.

Светското влијание на NGS

Придобивки од секвенционирањето на следната генерација

Споредете го NGS со други технологии и проверете дали е во право за вас и вашите истражувачки цели.

Секвенционирање на NGS наспроти Сангер

Научете ги клучните разлики помеѓу технологиите и видете кога NGS може да биде поефикасна опција.

NGS наспроти qPCR

Откријте како NGS нуди поголема моќ на откривање во споредба со qPCR, што го прави корисен метод за квантифицирање на варијациите.

NGS наспроти микронизи

Дознајте зошто секвенционирањето на РНК со NGS нуди широк динамички опсег и висока чувствителност за откривање нови транскрипти.

Како работи NGS

Основниот процес на секвенционирање од следната генерација вклучува фрагментирање на ДНК/РНК на повеќе парчиња, додавање адаптери, секвенционирање на библиотеките и нивно повторно составување за да се формира геномска секвенца. Во принцип, концептот е сличен на капиларна електрофореза. Критичната разлика е во тоа што NGS секвенционира милиони фрагменти на масовно паралелен начин, подобрувајќи ја брзината и точноста додека ги намалува трошоците за секвенционирање.

Како работи NGS

Вашиот работен тек на NGS

Подгответе се
Секвенца
Анализирај

Секвенционирањето на следната генерација вклучува три основни чекори: подготовка на библиотека, секвенционирање и анализа на податоци. Најдете ресурси кои ќе ви помогнат да се подготвите за секој чекор и видете пример на работниот тек за секвенционирање на целиот геном на микроби, вообичаена апликација NGS.

Упатства за NGS за почетници

Започнувањето со NGS може да биде полесно отколку што очекувате. Погледнете ги нашите бесплатни упатства за секој од главните чекори во работниот тек. Сакате персонализирана обука за вашата лабораторија дадена лице в лице или виртуелно? Ние го нудиме и тоа.

Планирање на буџет за НГС

Цената на NGS драстично се намали во последниве години, овозможувајќи им на лабораториите од сите големини да воведат секвенционирање во нивните студии. Постојат неколку фактори што треба да се земат предвид при планирањето на вашиот буџет, како што се лабораториската опрема и волуменот на примерокот.

Започнете со основите на NGS

Да почнеме со детален преглед на главните чекори во работниот тек на секвенционирање на следната генерација.

Заедницата на Илумина

Придружете се на другите клиенти на Illumina во онлајн заедницата на Illumina. Соработувајте со модераторите, клиентите и програмерите на Illumina. Дискутирајте за најдобрите практики, решавајте проблеми и дознајте како другите користат секвенционери на Illumina, комплети за подготовка на библиотеки и автоматска анализа на податоци за да го поттикнат нивното истражување.

Дополнителни ресурси

Избор на компанија NGS

Побарајте најдобра компанија за секвенционирање од следната генерација во класата со биоинформатички алатки погодни за корисникот и поддршка и услуга водечка во индустријата.

Речник за секвенционирање на следната генерација

Најдете дефиниции за вообичаени термини и илустрации на важни концепти во NGS.

NGS Workflow Consulting

Започнете побрзо со нашите експерти за експериментален дизајн.* Ќе ви помогнеме да дизајнирате работен тек на NGS што е соодветен за вас.

Придружете се на заедницата на Илумина

На нашиот отворен форум, истражувачите можат да се соберат за да се поддржат еден со друг, да поставуваат прашања и да соработуваат на големата наука.

Контактирајте не

*Не е достапно во земјите од Азија или Јужен Пацифик.

Само за истражувачка употреба

Не се користи во дијагностички процедури освен како што е конкретно наведено.

Иновативни технологии

Во Илумина, нашата цел е да примениме иновативни технологии за анализа на генетските варијации и функции, со што се можни студии кои не беа ни замисливи пред само неколку години. Од клучно значење за нас е да испорачаме иновативни, флексибилни и скалабилни решенија за да ги задоволиме потребите на нашите клиенти. Како глобална компанија која дава висока вредност на заедничките интеракции, брзата испорака на решенија и обезбедувањето највисоко ниво на квалитет, ние се стремиме да одговориме на овој предизвик. Иновативните технологии за секвенционирање и низа на Illumina поттикнуваат револуционерен напредок во истражувањето на науката за животот, преведувачката и потрошувачката геномика и молекуларната дијагностика.


Биоинформатички и биостатистички методи за ДНК метиломска анализа на дебелината

Сара Амандин Керолин Војзин, во Компјутерска епигенетика и болести, 2019 година

Кои софтвери и сетови на податоци треба да ги користам за да ги анализирам податоците за метилација на ДНК во контекст на дебелината?

Без оглед на избраната техника на метилација на ДНК (RRBS, Illumina низи, MeDIP-seq, Me-DIP чип, итн.), неодамнешните координирани напори на биоинформатичката заедница овозможија претходна обработка, филтрирање, нормализирање и извршување на сите видови статистички анализи на податоци за метилација на ДНК со Р статистичкиот софтвер. Во 2003 година, беше лансиран проектот Bioconductor со отворен код, со отворен развој, со цел да се обезбедат алатки за анализа и разбирање на геномски податоци со висок пропуст, користејќи го програмскиот јазик R. Тој се покажа исклучително успешен и сега е водечка платформа за анализа на податоците за метилација на ДНК, без разлика дали е во контекст на дебелина или во други контексти на болеста [15]. Меѓу 1473 пакети кои сега се на веб-страницата [16] , 68 вклучуваат алгоритми за преобработка и анализа на податоците за метилација на ДНК. Одличниот преглед на Тешендорф и Релтон детално ги опиша овие алгоритми и софтверски пакети за низводно анализи на податоци за метилација на ДНК, вклучувајќи алгоритми за деконволуција на типот на клетка, избор на карактеристики, како и анализа на патека, интегративна и системско ниво [17].

Праведно е да се каже дека не постои златен стандард за претходна обработка на податоците за метилација на ДНК од чиповите на Illumina, но има неколку важни чекори што треба да се спроведат за да се зголеми валидноста на резултатите. Прво, важно е да се изврши логитна трансформација на β вредностите, кои го претставуваат процентот на метилација при даден CpG, во M вредности. β вредностите се движат од 0 (ниту еден алел не е метилиран) до 1 (сите алели се метилирани) и се познати хетероскедастични кога се блиску до 0 и 1. Ова е проблем за повеќето статистички тестови кои претпоставуваат хомоскедастичност, но тоа може да се избегне со користејќи M вредности, дефинирани како M = log 2 ( β 1 − β ) , бидејќи M вредностите се приближно хомоскедастички [18] . Повеќето студии ги спроведуваат своите анализи со M вредности и ги известуваат своите резултати со β вредности, бидејќи β вредностите имаат појасна биолошка интерпретација. Второ, од примарна важност е да се земат предвид двата различни дизајни на сонда на чиповите Illumina HumanMethylation 450k и EPIC, наречени тип I и тип II дизајни. Поточно, β вредностите од типот II сонди се помалку точни и повторливи од типот I сонди и покажуваат различни распределби [19] . Можно е да се земе предвид оваа разлика во дизајнот на сондата или со анализа на двата типа на сонди одделно, или со нормализирање на вредностите на метилација директно со корекција базирана на врв (PBC) [19] , нормализација на бета-MIxture Quantile (BMIQ) [20 ] или Регресија на корелирани сонди (RCP) [21] . Има само мали разлики во перформансите помеѓу тие методи, но се чини дека RCP ги надминува сите и дека е пресметковно ефикасен [21] . Конечно, примероците често се изведуваат на различни плочи и на различни локации на плочите, со што се воведуваат познати сериски ефекти кои би можеле да имаат драматични последици врз анализата низводно ако распределбата на примерокот на плочите е нееднаква помеѓу групите. Можно е да се прилагоди за овој ефект на серија, или со додавање на бројот на плочата и локацијата на плочата како коваријати во статистичката анализа, или со нормализирање на податоците за метилација користејќи емпириски методи на Бејс (ComBat) [22] , анализа на сурогат променлива ( SVA) [23] , функционална нормализација [24] , Отстрани несакана варијација (RUVm) [25] и BEclear [26] . ComBat е многу популарен метод кој е лесен за имплементација, но RUVm е особено корисен за анализа на многу „неуредни“ множества на податоци, како што се оние што се обидуваат да комбинираат примероци од повеќе лаборатории/студии [25].

Научниците треба да се стремат да комбинираат повеќе збирки податоци од различни студии или да ги реплицираат нивните резултати во различни групи за да ги зајакнат нивните наоди. Податоците за метилација на ДНК не се толку чувствителни како генетските податоци и полесно се споделуваат во научната заедница. Сè повеќе списанија сега бараат од авторите да ги депонираат своите необработени и обработени податоци за метилација на ДНК на складишта со отворен пристап пред да биде прифатено објавувањето. Платформите Gene Expression Omnibus (GEO) [27] и ArrayExpress [28] содржат неколку илјади збирки на податоци за метилација на ДНК кај луѓето, кои сочинуваат вредно и недоволно искористено богатство за истражувачките групи кои работат на податоци за метилација на ДНК. На пример, голема епигеномска асоцијација студија (EWAS) за индексот на телесна маса [14] користеше збир на податоци од ГЕО базата за да изврши анализи на корелација меѓу ткивата, што доведе до откритие дека метилационите локуси се збогатени за функционални геномски карактеристики во повеќе ткива. Сепак, може да биде предизвик да се добијат фенотипски податоци за примероците депонирани на такви платформи со отворен пристап, бидејќи авторите имаат тенденција да споделуваат минимална количина на фенотипски информации кога поставуваат збирки податоци. Потоа станува застрашувачка задача да се контактира со секој автор на секој сет на податоци и треба да се направат напори овие фенотипски информации да бидат подостапни.


Чекори на работниот тек на NGS

Работниот тек за секвенционирање на следната генерација содржи три основни чекори: подготовка на библиотека, секвенционирање и анализа на податоци. Научете ги основите на секој чекор и откријте како да го планирате работниот тек на NGS.

Подготовка за работниот тек на NGS

Пред да започнете со работниот тек на секвенционирање од следната генерација, изолирајте ја и прочистете ја вашата нуклеинска киселина. Некои методи за екстракција на ДНК можат да воведат инхибитори, што може негативно да влијае на ензимските реакции што се случуваат во работниот тек на NGS. За најдобри резултати, користете протокол за екстракција оптимизиран за вашиот тип на примерок. За експерименти за секвенционирање на РНК, претворете ја РНК во cDNA со обратна транскрипција.

По извлекувањето, повеќето работни текови на NGS бараат чекор за КК. Препорачуваме користење на УВ спектрофотометрија за проценка на чистотата и флуорометриски методи за квантификација на нуклеинската киселина.

Чекор 1 во работниот тек на NGS: Подготовка за библиотека

Подготовката на библиотеката е клучна за успехот на вашиот работен тек на NGS. Овој чекор ги подготвува примероците на ДНК или РНК за да бидат компатибилни со секвенсер. Библиотеките за секвенционирање обично се создаваат со фрагментирање на ДНК и додавање на специјализирани адаптери на двата краја. Во работниот тек на секвенционирање на Illumina, овие адаптери содржат комплементарни секвенци што им овозможуваат на фрагментите на ДНК да се врзат за течената ќелија. Фрагментите потоа може да се засилат и прочистат.

За да се заштедат ресурси, повеќе библиотеки може да се здружат заедно и да се секвенционираат во исто време - процес познат како мултиплексирање. За време на врзувањето на адаптерот, во секоја библиотека се додаваат единствени индексни секвенци или „баркодови“. Овие баркодови се користат за да се направи разлика помеѓу библиотеките при анализа на податоците.

Ресурси за подготовка на библиотеката

Најдете упатства за квантификација на библиотеката и контрола на квалитетот.

Научете како да избегнете контаминација при прочистување на ДНК/РНК.

Чекор 2 во Работниот тек на NGS: Секвенционирање

За време на чекорот за секвенционирање на работниот тек на NGS, библиотеките се вчитуваат во ќелија за проток и се ставаат на секвенционерот. Групите на фрагменти на ДНК се засилуваат во процес наречен генерирање на кластери, што резултира со милиони копии на едноверижна ДНК. На повеќето инструменти за секвенционирање на Illumina, кластерирањето се случува автоматски.

Во процесот наречен секвенционирање со синтеза (SBS), хемиски модифицираните нуклеотиди се врзуваат за шаблонот на ДНК преку природна комплементарност. Секој нуклеотид содржи флуоресцентна ознака и реверзибилен терминатор кој го блокира инкорпорирањето на следната база. Флуоресцентниот сигнал покажува кој нуклеотид е додаден, а терминаторот е расцепен за да може следната база да се врзе.

По читањето на напредната нишка на ДНК, отчитувањата се измиваат, а процесот се повторува за обратната низа. Овој метод се нарекува секвенционирање со парен крај.

Секвенционирање по технологија на синтеза

Чекор 3 во Работниот тек на NGS: Анализа на податоци

По секвенционирањето, софтверот на инструментот ги идентификува нуклеотидите (процес наречен повикување на база) и предвидената точност на тие базни повици. За време на анализата на податоците, можете да ги увезете вашите податоци за секвенционирање во стандардна алатка за анализа или да поставите сопствена линија.

Денес, можете да користите интуитивни апликации за анализа на податоци за да ги анализирате податоците од NGS без обука за биоинформатика или дополнителен лабораториски персонал. Овие алатки обезбедуваат порамнување на секвенците, повикување варијанти, визуелизација на податоци или интерпретација.

Дознајте повеќе за анализа на податоци

Скокни-започнете го вашиот работен тек на NGS

Сакате да започнете побрзо? Консултирајте се со експерти за експериментален дизајн преку нашата услуга за дизајн и евалуација на работниот тек.* Ќе ви помогнеме да дизајнирате работен тек на NGS што е соодветен за вас, да ги обработите вашите примероци и да го генерирате вашиот прв сет на податоци NGS.

*Не е достапно во земјите од Азија и Јужен Пацифик.

Контактирајте не

Секвенционирање на целиот геном на микроби

Секвенционирањето на целиот геном на микроби може да се користи за да се идентификуваат патогени, да се споредат геномите и да се анализира антимикробната отпорност. Нашиот истакнат работен тек на NGS за оваа апликација ги опишува препорачаните чекори. Целиот работен тек продолжува од ДНК до податоци за помалку од 24 часа.

Изолација на ДНК

Користете комплет за екстракција за да изолирате ДНК од микробни колонии без воведување инхибитори. Препорачуваме да користите стаклени мониста. Проценете ја чистотата со помош на УВ спектрофотометрија и квантирајте ја ДНК користејќи флуорометриски методи.

Подготовка за библиотека

Подгответе и квантифицирајте ги библиотеките според протоколот наведен во Водичот за подготовка на ДНК на Illumina. Може да извршите и изборна проверка на квалитетот на библиотеката со помош на Agilent 2100 Bioanalyzer или Advanced Analytical Fragment Analyzer. Ќе ви требаат:

2,5 часа
Проценет влез на ДНК: 1–500 ng

Секвенционирање

Редоследете ги библиотеките во 2 × 150 bp, следејќи го протоколот наведен во системскиот водич за iSeq 100. Ќе ви требаат:

19,5 часа
Проценета излезна моќност: 1,2 Gb на 2 × 150 bp возење
Примероци по истекот: 4–5 примероци претпоставувајќи 5 Mb при покриеност од 50×

Анализа на податоци

Анализирајте ги податоците користејќи ја апликацијата BWA Aligner и визуелизирајте ги податоците користејќи ја апликацијата Integrative Genomics Viewer во BaseSpace Sequence Hub. Ќе ви требаат:


Блог за CD Genomics

Истражете го блогот што го развивме, вклучувајќи геномско образование, геномски технологии, геномски напредок и вести и погледи од геномијата.

Принцип и работен тек на секвенционирање на следната генерација на Illumina

Илумина, основана во 1998 година во Сан Диего, Калифорнија, е водечка компанија во областа на секвенционирање. Во 2006 година, Illumina ја купи Solexa, ја доби следната генерација технологија за секвенционирање со висока пропусност и ја разви во мејнстрим технологија на пазарот. Во моментов обезбедува системи за секвенционирање како што се MiSeq, HiSeq 2500, HiSeq 3000, HiSeq 4000, HiSeq X Ten, HiSeq X five, NextSeq 550.

Апликации на Illumina NGS

Основниот принцип на Illumina NGS

Методот на секвенционирање на следната генерација на Illumina (NGS) се заснова на секвенционирање по синтеза (SBS) и реверзибилни терминатори за боја кои овозможуваат идентификација на единечни бази додека се воведуваат во нишките на ДНК.

Работниот тек на Illumina NGS

Чекор 1. Подготовка на библиотека

Преку ултразвучна фрагментација, геномската ДНК станува фрагмент на ДНК со должина од 200-500bp. Адаптерот 5' и 3' се додадени на двата краја на овие мали сегменти, „тагментацијата“ ги комбинира реакциите на фрагментација и лигатура во еден чекор што значително ја зголемува ефикасноста на процесот на подготовка на библиотеката. Фрагментите поврзани со адаптер потоа се засилуваат со PCR и се прочистуваат со гел. Конструирана е библиотеката за секвенционирање.

Слика 1. Првиот чекор: подготовка на библиотеката

Чекор 2. Генерирање на кластери

Проточната ќелија е канал за адсорбирање на мобилни фрагменти на ДНК, а исто така е и сад за реактор за секвенционирање на јадрото — целото секвенционирање се случува овде. Фрагментите на ДНК во библиотеката за секвенционирање случајно ќе се прикачат на лентите на површината на проточната ќелија кога ќе минат низ неа. Секоја проточна ќелија има 8 ленти, секоја лента има одреден број адаптери прикачени на површината, кои можат да одговараат на адаптерите додадени на краевите на фрагментот на ДНК во процесот на градење, поради што ќелијата за проток може да ја адсорбира ДНК по зградата. и може да го поддржи засилувањето на мостот PCR на површината на ДНК. Теоретски, меѓу овие ленти нема взаемно влијание.

Мост PCR беше изведен со користење на адаптери на површината на проточната клетка како шаблон, по континуирано засилување и циклуси на мутација, секој фрагмент на ДНК на крајот ќе биде групиран во снопови на нивните соодветни локации, од кои секоја ќе содржи многу копии од еден образец на ДНК.

Целта на овој процес е да се засили интензитетот на сигналот на базата за да се задоволат барањата на сигналот за секвенционирање. Кога ќе заврши создавањето на кластери, тие шаблони се подготвени за секвенционирање.

Слика 2. Втор чекор: генерирање на кластери

Чекор 3. Секвенционирање

Методот на секвенционирање се базира на секвенционирање по синтеза (SBS). Во системот за реакција беа додадени ДНК полимераза, прајмери ​​за поврзување и 4 dNTP со флуоресцентни маркери специфични за базите. 3′-OH на овие dNTP се заштитени со хемиски методи, што гарантира дека ќе се додаде само една база истовремено за време на процесот на секвенционирање. Сите неискористени бесплатни dNTP и ДНК полимерази се елуираат по завршувањето на реакцијата на синтезата.

Потоа, се додава тампон раствор потребен за возбудување на флуоресценција, флуоресцентниот сигнал се возбудува со ласер, а флуоресцентниот сигнал се снима со оптичка опрема.

Конечно, оптичкиот сигнал се претвора во база на секвенционирање со компјутерска анализа. Кога ќе се снима флуоресцентниот сигнал, се додава хемиски реагенс за да се угаси флуоресцентниот сигнал и да се отстрани заштитната група dNTP 3′-OH, за да може да се изврши следниот круг на реакција на секвенционирање.

Слика 3. Третиот чекор: секвенционирање

Чекор 4. Порамнување и засилување Анализа на податоци

Новоидентификуваните читања на секвенците се порамнети со референтниот геном, потоа можни се многу варијации на биоинформатичката анализа како што се повикување SNP/InDel/SV/CNV, прибелешки и статистика, анализа на збогатување на патеката, анализа на популациска генетика и многу повеќе.

Слика 4. Четвртиот чекор: усогласување и анализа на податоци.

Горенаведеното е преглед на хемијата на Illumina NGS, технологијата SBS овозможува секвенционирање со еден крај и два краја, ја подобрува способноста за целосно идентификување на кој било геном.


Содржини

Технологијата за секвенционирање на Illumina работи во три основни чекори: засилување, секвенција и анализа. Процесот започнува со прочистена ДНК. ДНК е фрагментирана и се додаваат адаптери кои содржат сегменти кои дејствуваат како референтни точки за време на засилување, секвенционирање и анализа. Модифицираната ДНК е натоварена на проточна ќелија каде што ќе се врши засилување и секвенционирање. Проточната ќелија содржи нанобунари кои ги отвораат фрагментите и помагаат при пренатрупаноста. [6] Секој нанобунар содржи олигонуклеотиди кои обезбедуваат точка на закотвување за прицврстување на адаптерите. Откако фрагментите ќе се закачат, започнува фазата наречена генерирање на кластери. Овој чекор прави околу илјада копии од секој фрагмент од ДНК и се прави со PCR за засилување на мостот. Следно, прајмерите и модифицираните нуклеотиди се мијат на чипот. Овие нуклеотиди имаат реверзибилен 3' флуоресцентен блокатор, така што ДНК полимеразата може да додаде само по еден нуклеотид на фрагментот на ДНК. [6] По секој круг на синтеза, камерата го фотографира чипот. Компјутерот одредува каква база е додадена со брановата должина на флуоресцентната ознака и ја снима за секое место на чипот. По секој круг, неинкорпорираните молекули се мијат. Потоа се користи чекор на хемиско деблокирање за отстранување на 3’ флуоресцентната група за блокирање на терминалите. Процесот продолжува додека не се секвенционира целосната молекула на ДНК. [5] Со оваа технологија, илјадници места низ геномот се секвенционираат одеднаш преку масивно паралелно секвенционирање.

Геномска библиотека Уредување

Откако ќе се прочисти ДНК, треба да се генерира ДНК библиотека, геномска библиотека. Постојат два начини на кои може да се создаде геномска библиотека, сонификација и тагментација. Со тагментација, transposases случајно ја сече ДНК во фрагменти од 50 до 500 bp и додава адаптери истовремено. [6] Генетска библиотека може да се генерира и со користење на сонификација за фрагментирање на геномската ДНК. Сонификацијата ја фрагментира ДНК во слични големини користејќи ултразвучни звучни бранови. Десниот и левиот адаптер ќе треба да се прикачат со Т7 ДНК полимераза и Т4 ДНК лигаза по сонификацијата. Нишките на кои не им се врзани адаптери се измиени. [7]

Адаптери Уредување

Адаптерите содржат три различни сегменти: секвенцата комплементарна на цврстата поддршка (олигонуклеотиди на проточната ќелија), секвенцата на баркод (индекси) и местото на врзување за прајмерот за секвенционирање. [6] Индексите обично се долги шест базни парови и се користат за време на анализата на секвенцата на ДНК за да се идентификуваат примероците. Индексите овозможуваат до 96 различни примероци да се извршуваат заедно, ова е познато и како мултиплексирање. За време на анализата, компјутерот ќе ги групира сите читања со истиот индекс заедно. [8] [9] Илумина користи пристап „секвенца по синтеза“. [9] Овој процес се одвива во внатрешноста на стаклена проточна ќелија обложена со акриламид. [10] Проточната клетка има олигонуклеотиди (кратки нуклеотидни секвенци) кои го обложуваат дното на клетката, и тие служат како цврста потпора за држење на ДНК нишките на место за време на секвенционирањето. Како што фрагментираната ДНК се мие преку проточната ќелија, соодветниот адаптер се прикачува на дополнителната цврста поддршка.

Засилување на мостот Уреди

Откако ќе се прикачи, може да започне генерирањето кластери. Целта е да се создадат стотици идентични нишки на ДНК. Некои ќе бидат напред влакно, остатокот, обратно. Затоа се користат десниот и левиот адаптер. Кластерите се генерираат преку засилување на мостот. ДНК полимеразата се движи по влакно на ДНК, создавајќи нејзина комплементарна низа. Оригиналната жичка се измива, оставајќи ја само обратната жичка. На врвот на обратната жичка има низа на адаптер. Врската на ДНК се свиткува и се прицврстува на олигото што е комплементарно на горната секвенца на адаптер. Полимеразите се прикачуваат на обратната жичка и се прави нејзината комплементарна жичка (која е идентична со оригиналот). Сега двојно-верижната ДНК е денатурирана така што секоја влакно може посебно да се прикачи на олигонуклеотидна секвенца закотвена на проточната ќелија. Едната ќе биде обратна жичка другата, напред. Овој процес се нарекува засилување на мостот и се случува за илјадници кластери низ целата проточна ќелија одеднаш. [11]

Клонално засилување Уреди

Постојано и одново, нишките на ДНК ќе се наведнуваат и ќе се закачат на цврстата поддршка. ДНК полимеразата ќе синтетизира нова нишка за да создаде двоверижен сегмент, и тој ќе биде денатуриран така што сите ДНК нишки во една област се од еден извор (клонално засилување). Клоналното засилување е важно за целите на контролата на квалитетот. Ако се открие дека влакно има непарна низа, тогаш научниците можат да ја проверат обратната низа за да се уверат дека има комплемент со истата необичност. Напредната и задната страна делуваат како проверки за заштита од артефакти. Бидејќи секвенционирањето на Илумина користи ДНК полимераза, забележани се грешки во замената на базата, [12] особено на 3' крајот. [13] Спарените крајни отчитувања комбинирани со генерирање кластери може да потврдат дека настанала грешка. Назад и напред треба да бидат комплементарни една со друга, сите обратни отчитувања треба да се совпаѓаат едни со други, а сите напредни отчитувања треба да се совпаѓаат едни со други. Ако читањето не е доволно слично на неговите колеги (со кои треба да биде клон), можеби се појавила грешка. Во анализите на некои лаборатории се користи минимален праг од 97% сличност. [13]

Низа по синтеза Уреди

На крајот на клоналното засилување, сите обратни нишки се измиваат од ќелијата за проток, оставајќи ги само напредните нишки. Прајмерот се прикачува на местото за врзување на прајмерот на адаптерот на предните нишки, а полимеразата додава флуоресцентно означен dNTP на ДНК-жицата. Може да се додаде само една база по круг поради тоа што флуорофорот делува како блокирачка група, меѓутоа, групата за блокирање е реверзибилна. [6] Користејќи ја хемијата на четири бои, секоја од четирите бази има уникатна емисија, а по секој круг, машината евидентира која база е додадена. Штом бојата се снима, флуорофорот се измива и друг dNTP се мие преку ќелијата за проток и процесот се повторува. dATP, dTTP, dGTP и dCTP се мијат преку клетката посебно, така што секој нуклеотид може да се идентификува.

Почнувајќи со лансирањето на NextSeq, а подоцна и на MiniSeq, Illumina воведе нова хемија за секвенционирање во две бои. Нуклеотидите се разликуваат или по една од двете бои (црвена или зелена), без боја („црна“) или со комбинирање на двете бои (се појавуваат портокалова како мешавина помеѓу црвено и зелено).

Откако ќе се прочита нишката на ДНК, нишката што штотуку беше додадена се измие. Потоа, прајмерот со индекс 1 се прицврстува, ја полимеризира низата од индекс 1 и се измива. Влакното повторно формира мост, а 3'-крајот на нишката на ДНК се прикачува на олиго на проточната ќелија. Прајмерот со индекс 2 се прицврстува, ја полимеризира низата и се измива.

Полимеразата ја секвенцира комплементарната влакно на врвот на заоблената влакно. Тие се одвојуваат, а 3' крајот на секоја жичка е блокиран. Напредната жичка се измива, а процесот на секвенца со синтеза се повторува за обратната жичка.

Анализа на податоци Уреди

Секвенционирањето се случува за милиони кластери одеднаш, и секој кластер има

1.000 идентични копии на инсерт на ДНК. [12] Податоците за низата се анализираат со пронаоѓање на фрагменти со преклопувачки области, наречени контиги, и нивно порамнување. Ако е позната референтна секвенца, контигите потоа се споредуваат со неа за идентификација на варијантата.

Овој поделен процес им овозможува на научниците да ја видат целосната секвенца, иако нефрагментирана низа никогаш не била извршена, сепак, бидејќи должините на читање на Illumina не се многу долги [13] (HiSeq секвенционирањето може да произведе должини на читање долги околу 90 bp [8] ), може да биде борба за решавање на кратки области за повторување на тандем. [8] [12] Исто така, ако низата е de novo и не постои референца, повторените области може да предизвикаат многу потешкотии во склопувањето на низата. [12] Дополнителните потешкотии вклучуваат замена на базите (особено на 3' крајот на читањата [13] ) со неточни полимерази, химерични секвенци и PCR-пристрасност, кои сите можат да придонесат за генерирање на неточна секвенца. [13]

Оваа техника нуди неколку предности во однос на традиционалните методи на секвенционирање како што е секвенционирањето на Sanger. Секвенционирањето на Sanger бара две реакции, една за напредниот прајмер и друга за обратниот прајмер. За разлика од Илумина, секвенционирањето на Сангер користи флуоресцентно означени дидеоксинуклеозидни трифосфати (ddNTPs) за да се одреди низата на фрагментот на ДНК. На ddNTP им недостасува 3' OH групата и трајно ја прекинува синтезата на ДНК. [6] Во секоја реакциона цевка се додаваат dNTP и ddNTP, заедно со ДНК полимераза и прајмери. Односот на ddNTP и dNTP е важен бидејќи шаблонот ДНК треба целосно да се синтетизира, а прекумерното изобилство на ddNTP ќе создаде повеќе фрагменти со иста големина и позиција на шаблонот на ДНК. Кога ДНК полимеразата додава ddNTP, фрагментот се завршува и се синтетизира нов фрагмент. Секој синтетизиран фрагмент е за еден нуклеотид подолг од последниот. Откако шаблонот на ДНК е целосно синтетизиран, фрагментите се одвојуваат со капиларна електрофореза. На дното на капиларната цевка ласерот ги возбудува флуоресцентно означените ddNTP и камерата ја снима бојата што се емитува.

Поради автоматизираната природа на секвенционирањето на боите на Illumina, можно е да се редат повеќе нишки одеднаш и брзо да се добијат вистински податоци за секвенционирање. Со секвенционирањето на Sanger, само една нишка може да се секвенционира во исто време и е релативно бавна. Илумина користи само ДНК полимераза за разлика од повеќекратните, скапи ензими потребни од другите техники на секвенционирање (т.е. пиросеквенционирање). [14]

Секвенционирањето на Illumina се користи за истражување на транскриптомите на слаткиот компир [15] и родот gymnosperm Такси. [16]


Микробиом во заразни болести

Целно метагеномско секвенционирање

Целно метагеномско секвенционирање е секвенционирање на ДНК на специфично засилена област на геномот. Гените 16S rRNA и 18S rRNA се најчесто користените цели за бактерии/археи и еукариоти, соодветно. Врз основа на разновидноста на секвенците на рибозомалната РНК, може да се истражи структурата на микробиомот во однос на присуството и релативното изобилство. Конвенционалниот пристап вклучува клонирање на гени со целосна должина по PCR (со прајмери ​​кои го засилуваат целниот ген од широк опсег на микроорганизми), проследено со секвенционирање. Историски користениот пристап на секвенционирање Sanger (базиран на капилари) е заменет со технологии за секвенционирање на следната генерација (NGS). 16

16S rRNA ген

16S rRNA гените имаат конзервирани и променливи региони (Слика 8-3ai), каде што зачуваните области ја рефлектираат филогенетската врска меѓу видовите (и се користат како места за PCR прајминг) и многу променливи региони што ги рефлектираат разликите помеѓу видовите. Секвенционирање врз основа на капилари (генерирање

750 bp должина на читање) бара 2-3 читања за да се покрие целиот ген (

1,6 kb). Иако е многу точен (поради способноста да се долови целата должина на генот 16S rRNA), овој пристап е скап, одзема време, материјално неефикасен и трудоинтензивен. NGS платформите (како што се 454/Roche, Ion-Torrent и Illumina) произведуваат многу подлабоко примероци од микробните заедници додека ги намалуваат трошоците потребни за генерирање податоци. Должината на читање од 400-500 bp на платформата 454/Roche има многу ниска стапка на грешка и исто така може да покрие до три од деветте хиперпроменливи региони (на пр. V1 до V3 или V3 до V5). Може да се профилираат вкупно 96 примероци по регион, што изнесува вкупно 192 примероци по испитување, и

5000 читања по примерок. Додека чувствителноста (во однос на способноста да се идентификуваат таксони до најниското таксономско ниво) на овој пристап не е толку висока како секвенционирањето на генот 16S rRNA со целосна должина, пиросеквенционирањето во голема мера го унапреди нашето разбирање на микробиомот. Ефтин, скалабилен и високопропусен пристап за земање примероци од микробиолошки заедници е овозможен од двата секвенционери на јонски торенти (Ion PGM TM Sequencer и Ion Proton™), кои можат да генерираат до 400 bp читања на секвенца, 17,18 и платформата Illumina MiSeq, 19 која може да генерира спарени читања од 250–300 bp. Платформата MiSeq исто така може да земе примерок од еден регион покриен со едно читање или до три региони, што бара склопување на спарените читања. Во едно пуштање на MiSeq, може да се профилираат вкупно 384 примероци

20 000 читања по примерок (во просек, вкупно 7 милиони собрани читања). Треба да се забележи дека прајмерите дизајнирани да зафаќаат одредени променливи региони (Слика 8-3) може да недоволно претставуваат одредени таксономски клади. Со цел да се квантифицира и карактеризира оваа пристрасност од паровите на прајмери, студиите конструираа таканаречени „пробни“ заедници каде што е познат составот на бактериските видови и нивната застапеност. 20

Анализата на секвенцата на 16S вклучува аналитичка обработка (секување, скрининг и порамнување секвенци), проследено со микробно профилирање со споредби со секвенците на 16S rRNA во јавните бази на податоци или од оперативните таксономски единици (ОТУ) (види Слика 8-2) со користење на фреквентната дистрибуција на секвенците пронајдени во канти (со користење на прифатен праг од 3% ниво на различност за видовите и 5% за родот). Избраната таксономска длабочина често зависи од ситуацијата. Еколошките параметри кои ги дефинираат заедниците вклучуваат богатство, различност и рамномерност. Богатството го зема предвид бројот на единствени бактерии во заедницата, а разновидноста го одразува богатството и релативното изобилство на бактерии во популацијата (на пр. Шеноновиот индекс на разновидност), кој се намалува кога поделбата меѓу видовите станува помалку еднаква, при што еден вид доминира над другите. Рамномерноста ја претставува правичноста на заедницата и се заснова на проценка на богатството и различноста (на пр. Шеноновиот индекс на правичност). After determining ecological parameters, comparisons within and between groups (α and β diversity, respectively) are performed, and the level of saturation within the studied cohort per microbiome is determined (γ diversity) ( Figure 8-2 ).

18S rRNA Gene

Similar to the bacterial 16S rRNA genes, the eukaryotic 18S rRNA gene has conserved and variable regions. 18S rRNA gene sequences and their associated transcribed spacers (internal transcribed spacer ITS) 21,22 are used to classify fungi and eukaryotes. 23,24 ITS includes ITS1 (located between 18S and 5.8S rDNA) and ITS2 (between 5.8S and 28S rDNA Figure 8-3aii ). The variability in ITS1 and ITS2 is greater than 18S rDNA gene variability, so it is used to identify fungi and lower eukaryotes at species and subspecies levels. Co-sequencing of both 18S rDNA and ITS (e.g. ITS1-5.8S-ITS2) can provide more comprehensive classification of the eukaryotic components of the human microbiome. Selection for the amplification of the target region must be performed carefully because of primer biases (e.g., reference 25 ).

There is no current agreement as to the optimal regions to be amplified and sequenced. It is often a balance between finding primers that best amplify a determinative region, at the risk of losing the ability to more broadly characterize a bacterial and fungal/eukaryotic biomass. Targeted co-sequencing of the bacterial 16s rRNA and eukaryotic 18S rRNA genes 26–28 has been shown to efficiently characterize the microbiota on different habitats of the human body.


Резултати

We used five methods that take advantage of iTru or iNext indexing primers developed in Adapterama I in six exemplar amplicon sequencing projects. These projects illustrate the range of methodological approaches that can be used to overcome challenges of amplicon library preparation and fulfill most of the characteristics of an ideal amplicon library preparation system.

In all but one project (Table 4, project 1), we designed fusion primers to generate amplicons that can be amplified by iTru5 and iTru7 (or iNext5 and iNext7) primers to create full-length Illumina TruSeq (or Nextera) libraries. The indexed fusion primers utilize 20 (i.e., 8 + 12) internal identifying sequences with an edit distance ≥ 3 (Table 1) to create up to 96 internally dual-indexed amplicon libraries which were used individually or pooled for additional outer indexing by iTru5 and iTru7 (or iNext5 and iNext7) primers. Sequential PCRs that start with internally indexed primers create quadruple-indexed amplicon libraries that achieve our design goals of cost reduction, facilitation of large-scale multiplexing, increased base-diversity for Illumina sequencing, and maximization of efficiency of library preparation.

In our project characterizing the blood meals of kissing bugs (Table 4, project 1), we obtained an average of 116,902 reads for each sample and identified a total of five unique vertebrate species as the source of the blood meals. In our project identifying fungal pathogens in tree tissues (Table 4, project 2), we obtained an average of 436,825 reads per pool (i.e., 96 samples) and characterized the diverse fungal communities found in these samples. In our project characterizing plethodontid salamander communities from environmental DNA samples (Table 4, project 3), we obtained an average of 163,555 reads for each PCR replicate and identified reads matching 6/7 species expected to be present in the streams. In our project comparing basal DNA methylation of p21 (Table 4, project 4), we obtained approximately 10,000 reads per sample and detected differences in methylation of CpG sites between embryonic kidney cells and human proximal tubule cell (Kolli et al., 2019). In our project characterizing bacterial gut microbiomes (Table 4, project 5), we rarified to 15,000 quality-filtered reads per sample and identified an average of 3,847 OTUs per sample. In our project focused on the fine-scale population genetic analysis of Вистерија (Table 4, project 6), we obtained an average of 1,697 reads per sample and discovered little evidence of population structure among samples. Variation in the average number of reads among projects reflects the intentional allocation of reads when pooling with genomic libraries for sequencing for example, we pooled plates of libraries for the fungal pathogen project in relative quantities intended to generate approximately 4,000 reads per sample. Variation in the number of reads among samples within a given project likely reflects quantification error and variation in input DNA quantity and quality. Full results and associated figures for each project are detailed in File S3.

Figure 4: Total cost of experiments across the five methods given a number of samples.

(А) Метод 1 Метод 2 Метод 3 Метод 4 Метод 5
iTru buy-in $500 $500 $500 $500 $500
Oligo buy-in $103 $460 $290 $40 $445
Library Cost per sample $18.86 променлива променлива $4.44 променлива
Fixed cost $18.86 $3.12 $1.39 $4.44 $1.39
Variable cost $4.07 $17.52 $4.07
(Б) Library Cost per Sample for the given # of samples
# samples 1 $18.86 $7.19 $18.91 $4.44 $5.46
2 $18.86 $5.16 $10.15 $4.44 $3.43
8 $18.86 $3.63 $3.58 $4.44 $1.90
12 $18.86 $3.46 $2.85 $4.44 $1.73
24 $18.86 $3.29 $2.12 $4.44 $1.56
48 $18.86 $3.20 $1.75 $4.44 $1.47
96 $18.86 $3.16 $1.57 $4.44 $1.43
(C) Total experiment cost for given # of samples or plates (96 samples per plate)
# samples 1 $621.86 $967.19 $808.91 $544.44 $950.46
2 $640.72 $970.31 $810.30 $548.87 $951.85
8 $753.87 $989.03 $818.64 $575.48 $960.19
12 $829.31 $1,001.50 $824.20 $593.22 $965.75
24 $1,055.62 $1,038.94 $840.87 $646.45 $982.43
48 $1,508.24 $1,113.80 $874.23 $752.90 $1,015.78
96 $2,413.48 $1,263.53 $940.94 $965.80 $1,082.49
# plates 2 $4,223.96 $1,567.06 $1,091.87 $1,391.60 $1,219.98
3 $6,034.44 $1,870.59 $1,242.81 $1,817.40 $1,357.47
4 $7,844.92 $2,174.12 $1,393.74 $2,243.20 $1,494.95
5 $9,655.40 $2,477.66 $1,544.68 $2,669.00 $1,632.44

The costs associated with each method vary significantly, and which approach has the lowest cost depends on the number of samples processed (Fig. 4: note axis scales are not linear Table 5 File S6). In all cases, we present the costs associated with targeting a single locus for projects targeting multiple loci, these numbers can be adjusted to estimate the costs of purchasing necessary primers (i.e., locus-specific primers or fusion primers) and for more complicated pooling schemes. Methods 1 and 4 have the lowest buy-in cost, but the cost of library preparations are fixed, rather than decreasing as the number of samples increases. The constant cost per sample is due to the need for individual second round PCRs (e.g., iTru5/7). The other methods allow pooling of samples prior to second round PCR, which reduces costs. Because Method 1, with no use of fusion primers (non-indexed/indexed), has the highest library preparation costs per sample, it quickly becomes the most expensive method, more than doubling the cost of most other methods with as few as 96 samples. Method 4 remains economically reasonable for processing one or two plates of samples but becomes less reasonable as more plates of samples are used. Method 2 is never economically best, but it is sometimes necessary to achieve sufficient amplification to construct the desired libraries. Thus, Method 2 is only viable when the other methods fail. Method 3 has a moderate buy-in cost and the second-lowest cost per sample for large numbers of samples. Also, Method 3 has the lowest cost when ≤11 plates of samples will be processed, though the cost is very similar to Method 5 after ≥2 plates of samples are processed. Method 5 has the second highest buy-in costs, but the lowest costs per sample when large numbers of samples are processed. Method 5 is optimal when >12 plates of samples are processed. Because Methods 3 and 5 are similar in cost after a few plates of samples are processed, other considerations, such as workflow and personnel costs, are likely to drive decisions about the optimal method rather than the costs of reagents.


Supplementary Figure 1

Sequences of adapters, amplification and sequencing primers. Adapter sequences of a regular single-indexed Illumina multiplex library (as obtained using Illumina's TruSeq DNA sample preparation kit, cat. no. FC-121-2001/2002, or following the protocol provided in ref. 21 of the main text) are shown on top. Libraries prepared from single-stranded DNA differ by a deletion of 5 bp in the P5 adapter. Both library types are compatible with double-indexed sequencing (see ref. 22 of the main text for details). Amplification and sequencing primers are indicated by arrows. Primers with prefix 'IS' are further described in ref. 21 of the main text. (PDF 364 kb)

Supplementary Figure 2

Characterization of two DNA libraries prepared with and without uracil removal from a Neanderthal DNA extract (panels on the right and left, respectively). A) Fragment length distributions of the amplified libraries obtained from chip electrophoresis using the Bioanalyzer 2100. B) Fragment size distributions obtained from sequencing (the fraction of mapped sequences is indicated by a dotted line). C) Frequency of C to T substitutions around 5′and 3′ends of Neanderthal sequences. D) Average GC-content of Neanderthal sequences as a function of fragment size. (PDF 397 kb)

Supplementary Figure 3

Quality control of single-stranded adapter oligonucleotide CL78. From two independently synthesized batches of the oligonucleotide, 10 pmol were loaded onto a 10% denaturing polyacrylamide gel, next to a size marker (lane 1 20/100 ladder). The gel was run for 35 min at 200V and stained with SybrGold dye. While no impurities were detected in the first batch (lane 2), the second batch (lane 3) is dominated by a double-length artifact, representing an extreme example of poor oligonucleotide synthesis quality. (PDF 197 kb)

Supplementary Figure 4

Determining the optimal cycle number for indexing PCR using the qPCR amplification plots. Shown are the amplification plots obtained from quantifying the libraries prepared in the experiment described in 'Anticipated results'. The saturation phase of PCR starts after cycle 18 (sample libraries, red and blue) and cycle 23 (blank library, green), respectively. Assuming full amplification efficiency (i.e. a doubling of library molecules in each cycle), the optimal cycle number for indexing PCR can be determined as follows by correcting for differences in reaction volumes and the amount of template DNA: (i) qPCR was performed in 25 μl reactions, whereas indexing PCR is performed in 100 μl volume. Thus, 2 cycles should be added to allow for 4 times more end product. (ii) One microliter of a 1:20 library dilution was used for measurement, whereas 24 μl of the library are used for indexing PCR (480 times as much). This corresponds to 8.9 (rounded 9) cycles that should be deducted. Thus, 11 and 16 were estimated to be the optimal cycle numbers for indexing PCR. (PDF 278 kb)

Supplementary Table 1

Program settings of Cooling-ThermoMixer MKR13 recommended for single-stranded library preparation. The device may also be used to replace the vortexer in bead resuspension steps (use 'short mix' button). (PDF 255 kb)

Supplementary Table 2

P5 and P7 indexing primers. An identical set of P7 indexing primers was published before in ref. 21 of the main text. (PDF 331 kb)



Коментари:

  1. Hurlbert

    Говориме.

  2. Raidyn

    Еве и така е :)

  3. Rodd

    Верувам дека не сте во право. Јас сум во можност да го докажам тоа. Пишете ми во премиерот, разговарајте за тоа.

  4. Desiderio

    Според мене тоа е многу интересна тема. Ти предлагам да дискутираш овде или во ПМ.



Напишете порака